ارزيابي حساسيت سه پرايمر مختلف با استفاده از روش RFLP -PCR براي تمايز مولكولي مايكوباكتريوم هاي آتيپيك

Evaluation of sensitivity of three different primers using PCR- RFLP method for molecular differentiation of atypical mycobacteria

مقدمه: با افزايش عفونت هاي ناشي از مايكوباكتريوم هاي آتيپيك (Non- tuberculosis mycobacterium; NTM) در سال هاي اخير، تشخيص سريع اين دسته از اهميت ويژه اي برخوردار است. از آنجايي كه روش هاي فنوتيپي وقت گير و پرهزينه هستند، امروزه از روش هاي مولكولي به طور وسيعي براي شناسايي و تمايز گونه هاي مختلف مايكوباكتريوم ها استفاده مي شود. هدف ازاين مطالعه، تمايز مولكولي مايكوباكتريوم هاي آتيپيك با استفاده از سه پرايمر TB و 16S-23S rRNA gene spacer و hsp65 در روش RFLP -PCR و ارزيابي حساسيت اين پرايمرها است. بحث و نتيجه گيري: روش hsp65 PCR- RFLP از حساسيت و دقت بالايي براي تمايز گونه هاي مختلف مايكوباكتريوم هاي غير توبركلوزيس برخوردار است. يافته ها: از مجموع 48 نمونه، 8 نمونه (6/16%) MDR (مقاوم به چند دارو)، 4 نمونه ( 3/8%) حساس و 36 نمونه (75%) غيرMDR (مقاوم به يك دارو) بود. 13 نمونه (27%) تند رشد و ساير نمونه ها ( 73%) كند رشد بود. سرعت تشخيص پرايمر hsp65 در روش PCR- RFLP، در بسياري از گونه ها بالاتر از بقيه پرايمر ها گزارش شد. مواد و روش ها: بررسي روي 48 نمونه مايكوباكتريوم آتيپيك جدا شده از بيماران مبتلا به سل ريوي كه توسط تست هاي فنوتيپي شناسايي شده بودند، صورت گرفت. حساسيت دارويي با روش نسبي (Proportional method) انجام و قطعاتي از ژنهاي hsp65 ،16S-23S rRNA gene spacer توسط PCR تكثيريافت. سپس قطعات تكثير يافته توسط آنزيم هاي AVaII، HpaII، HphI, HaeIII، BsteII هضم و الگوي بدست آمده روي آگارز 2% بررسي شد.

Background : i Rapiddentification of atypical mycobacterium(Non-tuberculosis mycobacterium; NTM) is important because of increase of these organisms infection in recent years. As phenotypic tests are time consuming and expensive, nowadays the molecular methods are widely used for rapid identification of mycobacterium spcies. The aim of this study was molecular differentiation of atypical mycobacteria using three primers in the PCR- RFLP method and evaluation of sensitivity of primers. Materials and Methods: This study was performed on 48 atypical mycobacterium specimens separated from pulmonary tuberculosis (PTB) patients who were indentified by phenotypic tests. Drug susceptibility testing was performed by proportional method, the fragments of the 16S-23S rRNA gene spacer and hsp65 gene were amplified by PCR method. Subsequently the amplicons were digested with enzymes namely AvaII,HphI, HpaII, BstEII and HaeIII and electrophoresed on 2% agarose gel. Results: A total of 48 isolates, 8 (16.6%) had multi-drug resistant (MDR-TB), 4 (8.3%) had susceptible and 36 (75%) had non MDR ( combined resistance). 13 (27%) were rapid growing and 73% were slow growing . By rate detection of hsp65 PCR-RFLP primer was higher than other primers. Conclusion: hsp65 PCR- RFLP method was more specific and exact for differentiation of non tuberculosis mycobacterium(NTM).