طراحي ژن stxA موتانت (G234E- R170L -A231D) شيگلا ديسانتري و بهينه سازي بيان و تخليص پروتيين نوتركيب آن

Shigella dysentery stxA mutant (R170L-A231D-G234E) gene design and optimization of recombinant protein expression and purification

زمينه و هدف: شيگلا ديسانتري يكي از مهمترين باكتري هاي بيماريزا‌ي روده اي انسان است. شيگاتوكسين (سم اين باكتري) با ورود به سلول هاي اپيتليال باعث مهار سنتز پروتيين و مرگ سلولي مي شود. عليرغم مطالعات فراوان جهت توليد واكسن عليه آن، هنوز ضرورت تداوم مطالعه در حصول به پروتيين نوتركيب شيگاتوكسين نوع A (stxA) وجود دارد. اين مطالعه با هدف بررسي و تعيين جايگاه هاي مناسب جهش و طراحي ژن سينتتيك زير واحد stxA و سپس بيان و بهينه سازي آن و در نهايت بررسي روش تخليص آن جهت مطالعات بعدي ايمني زايي انجام شد. روش بررسي: در اين مطالعه توصيفي-آزمايشگاهي پس از طراحي و تهيه ژن صناعي pET28a/stxA موتانت (G234E– R170L -A231D)، واكنش PCR جهت كنترل صحت حضور اين ژن انجام گرديد. پس از انتقال اين وكتور به سلول ميزبان Bl21 DE3، بيان، بهينه سازي و نهايتاً تخليص پروتيين حاصل بررسي گرديد. يافته ها: نتيجه مطالعات اوليه منجر به طراحي ژن stxA موتانت گرديد. نتايج واكنش PCR با استفاده از پلاسميد سنتتيك نشان از صحت ژن مورد مطالعه داشت. پس از بيان اين ژن در سلول ميزبان Bl21 DE3، بهينه سازي آن نيز بررسي گرديد. در نتيجه توليد مقادير زيادي از اين پروتيين به شكل اجسام توده اي نشان داده شد. تخليص انكلوژن بادي و سپس محلول سازي پروتيين هاي مربوطه با استفاده از روش هاي تلفيقي صورت گرفت. نتيجه گيري: با توجه به مكانيسم اثر شيگاتوكسين و طراحي جهش هاي انتخابي با آرايش جديد در اين ژن، پيش بيني مي شود كه اين پروتيين بياني، داراي اثر سميت كمتري نسبت به ساير موتانت هاي قبلي داشته باشد، در نتيجه مي تواند به عنوان كانديد واكسن برتر مطرح گردد.

Background and aims: Shigella dysentery is one of the most important human pathogenic intestinal bacteria. Entrance of the shigella toxin into the epithelial cells inhibits protein synthesis leading to cell death. In spite of great investigations on vaccine production against S. dysentery, studying to achieve significant stxA recombinant protein still remains important. The objective of this study was to determine the appropriate mutation loci and designing stxA subunit synthetic gene, its further expression and optimization and ultimately assaying purification method for further immunization studies. Methods: Three mutant stxA gene including (R170L-A231D-G234E) were designed and the synthetic gene in pET28a plasmid was obtained and confirmed by PCR. Thereafter the plasmid was transformed into the host cell E.coli BL21 DE3 after which gene expression was optimized and protein purity assay was then performed. Results: Preliminary studies led to mutant stop gene design, after which it was confirmed by synthetic plasmid and PCR. Expression and optimization were then performed which resulted in large amount of protein inclusion bodies. Purification of inclusion bodies and protein which resulted solubilization was done with a combinatorial method. Conclusion: With regard to the mechanism of shiga toxin effect and favorable mutation design with new arrangement, less toxicity of expressing protein is predicted than previous other mutants, posing a better vaccine candidate