بررسي تنوع ژنتيكي زانتوموناس عامل لكه زاويه‌اي توسكا در استان‌هاي مازندران و گلستان با استفاده از BOX-PCR و*REP-PCR

Assessment of the genetic diversity of Xanthomonas the causal agent of alder angular spot in Mazandaran and Golestan provinces using BOX-PCR and REP-PCR

توسكا يكي از مهم‌ترين گونه‌هاي درختي جنگل‌هاي شمال كشور بوده و از نظر اقتصادي به عنوان چهارمين درخت تجاري محسوب مي‌شود. يك بيماري لكه برگي ناشي از گونه‌اي زانتوموناس در توسكا ييلاقي (Alnus subcordata subsp. Subcordata) در چند منطقه جنگلي استان مازندران گزارش شده است (Rahimian et al. 1383. 16th Iran. Plant Protec. Cong.,439). براساس يك بررسي ژنومي كه در سال‌هاي اخير انجام شده بود باكتري عامل بيماري بالاترين شباهت را به Xanthomonas arboricola داشت (Rahimian et al. 1387. 18th Iran. Plant Protec. Cong., 428). بررسي محدودي در زمينه همساني جدايه‌ها و پراكندگي بيماري (Rahimian et al. 1383. 16th Iran. Plant Protec. Cong., 439) انجام گرديد ولي اطلاع دقيقي از تنوع ژنتيكي جدايه‌هاي مناطق مختلف در دست نيست. بررسي حاضر به منظور ارزيابي همساني يا تنوع ژنتيكي جدايه‌هاي به دست آمده از مناطق مختلف استان‌هاي مازندران و گلستان انجام گرفت. از نظر ويژگي‌هاي فنوتيپي جدايه بسيار شبيه هم بوده و فقط در مصرف -Lسرين، لوسين، دكسترين، كويينات، تايروزين به عنوان منبع كربن اختلاف نشان دادند. تنوع ژنتيكي جمعيت باكتري عامل لكه زاويه‌اي توسكا با استفاده از BOX-PCR و REP-PCR انجام شد. DNA ژنومي جدايه‌ها به روش ليز قليايي استخراج و PCR در شرايط توصيه شده ورسالوويچ و همكاران (Versalovich et al. 1991. Nucleic Acids Res, 24: 6823 -6831) ولي با كاهش زمان واسرشت (Denaturing) انجام شد. محصول PCR در ژل آگارز 2 درصد الكتروفورز و ژل با اتيديوم برومايد رنگ آميزي گرديد. از ضريب تشابه جاكارد براي تعيين تشابه جدايه‌ها و از روش UPGAMA و نرم افزار NTSYS براي آناليز خوشه‌اي استفاده شد. آناليز خوشه‌اي نتايج به دست آمده با آغازگر BOXAIR نشان داد كه در سطح 80 درصد جدايه‌ها به 24 گروه تقسيم شدند. اين در حالي است كه جدايه‌هاي توسكا با جدايه استاندارد Xanthomonas arboricola pv. coryli نيز همين ميزان شباهت را نشان دادند. در سطح 63 درصد، جدايه‌هاي توسكا به 15 گروه تقسيم شده ولي با همين ميزان شباهت با Xanthomonas arboricola pv. pruni هم خوشه بودند. در سطح 40 درصد هم ضمن تقسيم شدن جدايه‌ها به 7 گروه، همساني مشابهي را با جدايه مرجع Xanthomonas arboricola pv. juglandis نشان دادند. با توجه به اين يافته‌‌ها مي‌توان نتيجه گرفت كه جدايه‌هاي عامل لكه زاويه‌اي توسكا تنوع زيادي داشته و در عين حال BOX-PCR توانايي متمايز ساختن پاتووارهاي متعلق به گونه Xanthomonas arboricola را ندارد. نتايج به دست آمده با آغازگر REP1R,REP2I نشان داد كه در سطح 78 درصد جدايه ها به 14 گروه تقسيم شدند. در حالي كه اين جدايه‌ها با پاتوارهاي X. arboricola pv. juglandis و X. arboricola pv. coryli نيز همين ميزان شباهت را نشان دادند. در سطح تشابه 57 درصد، جدايه‌ها به 7 گروه تقسيم شده و در همين ميزان شباهت با X. arboricola pv. pruni هم خوشه بودند. داده‌ها نشان مي‌دهند جدايه‌هاي توسكا داراي تنوع زيادي بوده و REP-PCR كارايي بهتري براي گروه بندي جدايه‌هاي عامل لكه زاويه‌اي توسكا دارد.

Alder (Alnus subcordata subsp. Subcordata) is one of the most important tree species in northern forests of Iran and is economically considered as the fourth commercial tree. A leaf spot disease of alder caused by Xanthomonas sp. has been reported from several forest regions of Mazandaran province (Rahimian et al. 1383. 16th Iran. Plant Protec. Cong., 439). According to a recent genomic study, the bacterial agent of this disease has the highest similarity to Xanthomonas arboricola (Rahimian et al. 1387. 18th Iran. Plant Protec. Cong., 428). Though limited studies have been performed about the homology of isolates and the distribution of the disease (Rahimian et al. 1383. 16th Iran, Plant Protec. Cong., 439), detailed information is not available about the genetic diversity of isolates from different regions. This study was conducted to evaluate the genetic similarity or diversity among the isolates obtained from different regions of Mazandaran and Golestan provinces. Phenotypic characteristics of isolates were very similar and they were different only in utilization of carbon sources including L- Serin, Leucine Dextrin, Quinate, Tyrosine. The population genetic diversity analysis of the bacterial pathogen of alder angular leaf spot was performed using BOX-PCR and REP-PCR. Genomic DNA was extracted from isolates using alkaline lysis, and PCR was performed as recommended by Versalovich et al., but by reducing the deneturing time (Versalovich et al. 1991. Nucleic Acids Res, 24: 6823 -6831). PCR products were electrophoresed in 2 percent agarose gel and the gel was stained with ethidium bromide. Similarity, matrix of the isolates was obtained using Jaccardʹs coefficient and cluster analysis by employing the UPGAMA method and NTSYS software. Cluster analysis by BOXAIR primer showed that the isolates were divided into 24 groups at 80 percent level. However, the isolates of alder showed the same similarity with standard isolate Xanthomonas arboricola pv. coryli. At 63 percent level, alder isolates were divided into 15 groups, but with the same amount of similarity they were clustered with Xanthomonas arboricola pv. pruni. At 40 percent level, alder isolates were divided into seven groups and showed similar homology with reference isolate of Xanthomonas arboricola pv. juglandis. According to these findings, it can be concluded that isolates inciting alder angular leaf spot have high variability, while BOX-PCR was unable to differentiate X. arboricola pathovars. Results obtained with REP1R and REP2I primers showed that at 78 percent level, isolates were divided into 14 groups. In contrast, the isolates showed the same level of similarity with X. arboricola pv. juglandis and X. arboricola pv. coryli pathovars. At 57 percent similarity level, the isolates were divided into seven groups and were clustered with X. arboricola pv. pruni with the same amount of similarity. The data show that alder isolates have high variation and REP-PCR has a better efficiency for grouping causal agent of angular leaf spot of alder isolates.