چكيده فارسي :
بيماري خوشه صمغي غلات در ايران تا سال 1389 فقط از گندم گزارش و عامل آن دو گونه Rathayibacter tritici و R. iranicus تشخيص داده شده بود (بابايي زاد، و. و رحيميان، ح. 1381؛ رحيميان، ح.، 1372). در سال هاي 89- 1388جدايه هايي از باكتري عامل بيماري براي اولين بار از جو (Hordeum vulgare) جداسازي و به عنوان گونه اي از جنس Rathayibacter شناسايي گرديد (سلطاني، م.، فولادوند، ع.، رحيميان، ح. و بابايي زاد، و. 1389). در بررسي حاضر جدايه هايي از باكتري هاي عامل خوشه صمغي گندم و جو از مناطق مختلف كشور جمع آوري شده و ويژگي هاي فنوتيپي و نيز برخي از خصوصيات ژنوتيپي آنها تعيين شد. جدايه ها گرم مثبت، هوازي اجباري، كاتالاز مثبت، اكسيداز و آرجي- نين دهيدرولاز منفي بوده و توليد اندول و استويين نكردند. هيچ يك قادر به هيدروليز ژلاتين، نشاسته و كازيين نبودند ولي اسكولين و تويين 80 را هيدروليز كردند. نتايج آزمون هاي لهانيدن برش هاي سيب زميني، احياي نيترات، توليد لسيتيناز، فسفاتاز، اوره آز، تايروزيناز، كتولاكتوز و نيز واكنش متيل رد آنها منفي بود. جدايه ها قادر به استفاده از زايلوز، آرابينوز، مانيتول، اينولين، سيترات، فومارات، استات و پكتات بوده ولي از مالونات، پيروات، سيتراكونات و نيكوتينات استفاده نكردند. از گلوكز، گالاكتوز، فروكتوز و مانوز اسيد توليد كرده ولي توانايي توليد اسيد از رامنوز، رافينوز و ساليسين را نداشتند. جدايه‌هاي جو بر خلاف جدايه‌هاي گندم از ال- تارتارات و سوكسينات استفاده نكرده اما آميگدالين را مصرف نمودند. جدايه‌هاي عامل خوشه صمغي گندم بر اساس ويژگي هاي فنوتيپي به عنوان، گونه‌هاي tritici Rathayibacter و R. iranicus شناسايي شدند (Zgurskaya, H. I., Evtushenko, L. I., Akimov, V. N. & Kalakoutskii, L. V. 1993.) .جدايه‌هاي جو و R. iranicus برخلاف tritici R. روي محيط CNS رشد نكرده و قادر به استفاده از سباسينات نبودند. مقايسه نقوش پروتييني جدايه‌ها با جدايه‌هاي استاندارد گونه هاي (Rathayibacter toxicus ICMP 9525,International Collection of Microorganisms from Plants, Aackland, New Zeeland, و R. iranicus IBSBF 636, R rathayi IBSBF 635, R. tritici IBSBF632 Biological Institute Culture Collection Phytopathogenic Bacteria, Compinas, Brasil,) ، منجر به تفكيك آنها به سه گروه شد. تعدادي از جدايه‌هاي گندم با جدايه استاندارد tritici R. در يك گروه و بقيه آنها به همراه جدايه استاندارد R. iranicus در گروه ديگر قرار گرفتند. جدايه‌هاي جو گروه مستقلي را تشكيل دادند و با هيچ كدام از جدايه‌هاي استاندارد هم گروه نشدند. براي تعيين ارتباط نسبي ژنومي جدايه‌ها از روش BOX-PCR (Versalovich, J., Schneider M. de Bruijn F.J and Lupski, J. R. 1994.) و با استفاده از آغازگر BOXA1R (ساخته شده توسط شركت سيناژن) پيروي گرديد. شرايط زماني و دمايي شامل مرحله واسرشت‌سازي اوليه در دماي ?C 95 به مدت 4 دقيقه، 34 مرحله شامل واسرشت‌سازي در ? C 94 به مدت 1 دقيقه، اتصال آغازكر به DNA ژنومي در ?C 50 به مدت 1 دقيقه، تكثير DNA در ?C 72 به مدت 1 دقيقه و يك مرحله بسط نهايي نيز در ?C 72 به مدت 10 دقيقه اعمال شد. آناليز نقوش الكتروفورزي محصول PCR ، بر اساس وجود يا عدم وجود قطعات همسان در جدايه‌ها و تعيين ضريب تشابه ژاكارد (Jaccard coefficient) انجام شد. دندوگرام با استفاده از ميانگين‌هاي بي وزن (Unweighted pair group method with arithmetic averages, UPGMA) و با نرم افزار NTSYS-pc نسخه 02/2 محاسبه و ترسيم گرديد. بر اساس نقوش قطعات DNA جدايه ها در سطوح تشابه 48، 57، 71 و 89 درصد به ترتيب در دو، سه، شش و سيزده گروه قرار گرفتند. جدايه‌هاي گندم و جو با جدايه استاندارد R. toxicus كمترين شباهت را داشته و در سطح تشابه 21 درصد از آن جدا شدند. جدايه‌هاي جو با جدايه‌هاي استاندارد R. iranicus ، R. rathayi و R. tritici به ترتيب در سطوح 75، 56 و 50 درصد شباهت داشتند. يكي از جدايه‌ها كه در آزمون‌هاي فنوتيپي با گونه R. tritici مطابق بود با اين جدايه در سطح 48 درصد شباهت داشت در حالي‌كه به جدايه R. rathayi در سطح 55 درصد شبيه بود. جدايه ديگري كه بر مبناي آزمون‌هاي فنوتيپي به عنوان R. iranicus شناسايي شده بود با اين گونه در سطح 66 درصد شباهت داشت ولي به R. rathayi در سطح 71 درصد شبيه بود. هرچند تفاوت قابل ملاحظه اي در ويژگي هاي فنوتيپي جدايه هاي هر گونه ديده نشد، اما از نظر ژنتيكي تفاوت هايي در بين آنها مشهود بود. با توجه به ويژگي هاي ياد شده، احتمال مي رود جدايه هاي جو متعلق به گونه توصيف نشده اي از Rathayibacter باشد كه تعيين موقعيت دقيق تاكسونوميكي آن ها مستلزم انجام آزمون هاي وسيع تر ژنوتيپي است.
چكيده لاتين :
Gummy spike blight diseases of cereal has only been reported on wheat up to 2010 and the causative agents identified as Rathayibacter tritici and R. iranicus (Babaeezad, V., Rahimian, H. 2002. Iran. J. Plant Pathol. 38:47-55; Rahimian, H.1993. Proc. 11th, Iran. Plant Protec. Cong., Guilan Univ., Rasht, Iran. 35. Abst.). In the years 2010 and 2011, symptoms of gummy spike blight were observed on barley (Hordeum vulgare) in Ilam province and the associated bacterium was isolated and identified as a Rathayibacter species phenotypically non assignable to any species (Soltani. M., Fuladvand. A., Rahimian, H. and Babaeezad, V. 2010. Proc. 19th. Iranian Plant Protection Cong. P 429. Tehran, Iran). In the present study, strains of the bacterium associated with gummy spike blight were isolated from infected wheat and barley plants from several areas of Iran and their phenotypic and some genotypic features were determined. All strains were gram-positive, aerobic and catalase positive, but negative in tests for indole and acetoin production. The strains hydrolyzed esculin and Tween80 but not gelatin, starch, or casein. None of them produced oxidase nor arginine dihydrolase. Results of tests for potato rot, nitrate reduction, lecithinase, phosphatase, urease, tyrosinase, ketolactose and methyl red reaction were negative. The strains utilized xylose, L-arabinose, mannitol, inulin, citrate, fumarate, acetate and pectate but did not use malonate, pyruvate, citraconate and nicotinate. They produced acid from glucose, galactose, fructose, and mannose but not from rhamnose, raffinose or salicin. Strains isolated from barley, in contrast to isolates from wheat, used amygdalin but not succinate or L-tartarate. Both R. tritici and R. iranicus are found to be the species associated with these characteristics (Zgurskaya, H. I., Evtushenko, L. I., Akimov, V. N. & Kalakoutskii, L. V. 1993. Int J Syst Bacteriol. 43, 143-149). Strains isolated from barley and R. iranicus isolates in contrast to the strains identified as R. tritici, could not grow on CNS medium and were unable to use sebacate. Comparison of the protein profiles of the isolates with those of Rathayibacter toxicus strain ICMP 9525 (International Collection of Microorganisms from Plants, Aaukland, New Zeeland), R. iranicus strain IBSBF 636, R rathayi strain IBSBF 635 and R. tritici strain IBSBF 632 (Biological Institute Culture Collection Phytopathogenic Bacteria, Compinas, Brasil,) led to differentiation of the isolates into three groups. Based on the phenotypic features and the protein profiles, four isolates of wheat were similar to R. tritici and twenty two isolates were almost identical with the R.iranicus type strain. Strains isolated from barley formed an independent group. BOX-PCR wiht BOX A1R as primer (Versalovich, J., Schneider M. de Bruijn F.J and Lupski, J. R. 1994. Methods Mol Cell Biol 5: 25-40) was used to assess the genetic heterogeneity of the strains. The method was carried out as described by Versalovich et al. (Versalovich, J., Koeuth, T. and Lupski, J. R. 1991. Nucleic acids res. 19:6823-6831). Time and temperature conditions consisted of a predenaturation step for 4 minutes (min) at 95 ?C for 4 min, followed by 34 steps of denaturation at 94 ?C, annealed at 50 ?C for 1 min and extended at 72 ?C for 1 min ; a final extension step of 10 min at 72 ?C was also included. The products were electrophoresed in 1/5% agarose gel and the patterns scored for the presence or absence of prominent DNA bands. Similarity matrix of the strains was prepared using the Jaccard coefficient and cluster analysis, and the UPGMA method was performed using NTSYS-pc. At the similarity levels of 48%, 57%, 71% and 89%, the isolates fell into two, three, six and thirteen groups, respectively. The lowest similarity level (21%) was found between the strains isolated from wheat and barley with R. toxicus. Barley was similar to R. iranicus, R. rathayi and R. tritici at the levels of 75%, 56% and 50%, respectively. A wheat isolate showed phenotypically 66% similarity to type strain of R. iranicus, whereas its similarity to the type species of R. rathayi was 71%. Overall, although there was only slight phenotypic difference among the strains in each species, genetic heterogeneity was discernible in members of both species. At the present, barley isolates with characteristics intermediate among R. iranicus, R. tritici and R. rathayi, can be regarded as strains of a potentially undescribed species. Positive taxonomic identity and placement of these strains is pending the results of more experiments on genotypic features of their representative strains.
