ساخت حامل هاي بياني PEP cDNA موشي و EGFP در سامانه القايي Tet Off

پراكسي‌زوم‌ها يكي از اندامك هاي سلول‌هاي يوكاريوتي هستند كه داراي وظايف گوناگوني مي باشند. يكي از پروتيين‌هاي ماتريكس پراكسي‌زوم به نام پروتيين پراكسي‌زومي (PEP) ناميده مي شود كه در سال 2002 كلون گرديد. PEP واجد 209 اسيد آمينه است و به نظر مي رسد كه در تمايز بافت هاي جنين موش نقش دارد. از جمله خصوصيات اين پروتيين، افزايش بيان طي ميوژنز و تمايز مغز جنين موش مي باشد. براي تحقيق برروي نحوه‌ي عملكرد اين پروتيين بر مكانيسم نوروژنز نياز بود كه بتوان در مراحل مختلف نوروژنز، اين ژن را خاموش يا روشن كرد و نتايج حاصل از تغيير در بيان آن را بررسي نمود. لذا در مطالعه حاضرPEP cDNA را در سيستم بياني يوكاريوتي سامانه القايي Tet off وارد نموديم تا بتوان در آينده آن را به رده سلولي بنيادي ترانسفكت نماييم و بيان بيش از حدآن را توسط داكسي سيكلين يا تتراسيكلين با تنظيم سطح آنتي بيوتيك در سلول‌هاي بنيادي موشي بررسي نماييم. براي اين منظور نياز بود كه cDNA هدف تكثير شود و سپس به داخل حامل الحاق گردد. بنابراين در طراحي پرايمر وجود دو محل برش آنزيم محدودالاثر در ابتدا و انتهاي ژن همساز با حامل و همچنين توالي Kozak جهت بيان بيشتر پروتنين PEPدرنظر گرفته شد و PEP cDNA تكثير گرديد. با تاثير آنزيم هاي محدودالاثر در دو انتهاي PEP cDNA نهايتا قطعه برش يافته به داخل حامل pTRE2pur از سيستم بياني Tet off وارد شد. سيستم بيانيTet off يك سيستم بياني دوگانه مي‌باشد، به اين معني كه واجد يك وكتور به نام Tet off است كه يك عنصر پروتييني را توليد كرده كه به واسطه‌ي آنتي بيوتيك تتراسيكلين يا داكسي‌سيكلين بيان ژن را در وكتور دوم به نام pTRE2pur، روشن و خاموش مي‌كند. در اين سيستم ابتدا بايد وكتور Tet off را به سلول هدف ترانسفكت كرده و دودمان سلول پايدار ايجاد نمود و سپس وكتور دوم (pTRE2pur) كه حامل ژن است را به اين دودمان وارد نمود. براي اينكه به طور يقين پايدار بودن سلول به حامل Tet off را به اثبات برسانيم، علاوه بر ساخت ,TRE2pur/PEP cDNA EGFP را بداخل حامل TRE2pur وارد نموده و سازه TRE2pur/EGFP را تهيه نموديم.