توليد آنتي بادي اختصاصي پروتيين PGIP1 بيان شده به صورت هترولوگ در باكتري و استفاده از آن جهت تاييد بيان PGIP در گياهان كلزاي تراريخت

Antibody Production against the heterologous expressed PGIP1 to confirm the transgenic canola plants

قارچهاي بيماريزاي كلزا كه سالانه خسارت زيادي را به اين محصول وارد مي كنند براي نفوذ در گياه، با ترشح آنزيمهايي باعث تجزيه مولكولهاي ديواره سلولي آنها مي شوند. در طي تكامل در گياهان، پروتيينهايي براي مهار اين آنزيمها بوجود آمده است. PGIP1 از جمله اين پروتيينها بوده كه قدرت نفوذ قارچ در گياه را مهار مي نمايد. در اين تحقيق با توجه به اينكه آنتي بادي عليه پروتيين PGIP1 لوبيا به صورت تجاري موجود نمي باشد و از طرفي جهت تاييد بيان PGIP1 در گياهان كلزاي تراريخت بدست آمده نياز به آنتي بادي مربوطه مي باشد، لذا اقدام به توليد پروتيين PGIP1 در سيستم پروكاريوتي و استفاده از آن جهت توليد آنتي بادي عليه آن گرديد. بدين منظور ژن كد كننده PGIP1 كلون شده در pUC19 بوسيله آغازگرهاي اختصاصي RB وRB2H (به ترتيب حاوي سايتهاي Nde1 وXho1) تكثير و پس از هضم با اين دو آنزيم در ناقل pET26b(+) كلون گرديد. پلاسميد حاصله پس از تاييدهاي مولكولي به ميزبان بياني E. coli BL21 (DE3)pLysS منتقل گرديد. جهت بهينه سازي شرايط بيان ژن مورد نظر، شرايط مختلفي شامل، غلظتهاي متفاوتIPTG، دماهاي متفاوت كشت و OD زمان القا در كلونيهاي متفاوت مورد بررسي قرار گرفت و نهايتاً OD=0.3 ، دماي 37 درجه سانتي گراد و IPTG =0.5mM بعنوان بهترين شرايط بياني معرفي گرديد. از آنجا كه توالي هيستيدين در انتهاي پروتيين كد شده وجود دارد، جهت تاييد بيان پروتيين PGIP1 توسط آزمون وسترن بلات از آنتي بادي Anti-His استفاده گرديد. پروتيين خالص شده در شش نوبت به دو خرگوش تزريق شد. جهت بررسي ميزان تيتر آنتي بادي از آزمون الايزا استفاده گرديد. از آنتي بادي توليد شده جهت تاييد بيان پروتيين PGIP1 توليد شده در گياهان كلزاي تراريخت استفاده گرديد. نتايج حاصل از آزمون وسترن بلات وجود پروتيين مورد نظر را در پروتيينهاي استخراج شده از برگ گياهان كلزاي تراريخت در مقايسه با كلزاي غير تراريخت تاييد نمود.

Phytopathogenic fungi cause serious yield losses of oilseed crops including canola. Many phytopathogenic fungi produce polygalacturonase enzymes (PGs) which are thought to play an important role to degrade the pectin component of plant cell walls. On the other hand polygalacturonase-inhibiting proteins (PGIPs) which are cell wall bounded proteins are secreted by plants and they defend the cell walls against PGs. Due to the lack of commercial PGIP1 antibody, in this study PGIP1 was expressed in prokaryotic system to be used for production of antibody. The pgip gene was amplified using two primers RB and RB2H contaning NdeI and XhoI sites respectively and cloned in pET26b(+).The new construct was confirmed and transferred to E. coli BL21 (DE3) pLysS. The optimized conditions for expression of PGIP1 was IPTG = 0.5mM ,OD = 0.3 and 37?C for culture temperature. The expression of PGIP1 was confirmed using Anti-His antibody due to the presence of His-tag in expressed protein. The antibody against the expressed protein (PGIP1) was produced and the obtaining serum tested by Elisa. This antibody used for Western blotting to confirm the presence of the expressed PGIP1 in protein profile of transgenic canola plants. Western blot analysis of transgenic lines compared to non-transgenic line of canola plants confirmed the expression of PGIP1 in transgenic lines.