تعيين ترادف ژنوم ويروييد كوتولگي رازك از درختان مبتلا به بيماري كاككسياي مركبات مازندران

Nucleotide sequence of Hop stunt viroid cDNA from Cachexia-infected citrus plants in Mazandaran province

بيماري كاككسيا در اكثر مناطق مركبات‌كاري در دنيا ديده مي‌شود. علايم اين بيماري به صورت كوتولگي، صمغ زير پوست، زردي و ضعف درختان، ساقه آبله‌اي و ناسازگاري در محل اتصال پايه و پيوندك مي‌باشد كه در بسياري از درختان مركبات استان مازندران مشاهده گرديده است. در سال 1384 هشت درخت مركبات داراي علايم بيماري كاككسيا از دو منطقه مركبات‌كاري شهرستان ساري انتخاب و از برگهاي جوان آنها با استفاده از فنول اسيدي آر. ان. ا استخراج شد. آزمون واكنش زنجيره‌اي پليمراز با نسخه‌برداري معكوس (RT-PCR) با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي ويروييدهاي كوتولگي رازك و ويروييدهاي ديگر مركبات نظير اگزوكورتيس، خميدگي برگ ، III و IV مركبات و ژن مولد پروتيين پوششي ويروس تريستزاي مركبات (CTV , CP25) براي شناسايي عامل احتمالي مولد بيماري كاككسيا نشان داد كه درختان مبتلا فقط حاوي ويروييد كوتولگي رازك مي‌باشند. نوار دي. ان. ا تكثير شده در PCR با استفاده از كيت خالص‌سازي (High Pure PCR Product Purification Kit , Roche) شركت روش آلمان از ژل آگاروز بازيافت و با آناليز چند شكلي فرم فضايي رشته‌هاي تك‌لا (SSCP) ارزيابي شد. دو جدايه متفاوت در SSCP ، انتخاب و در پلاسميد pBluescript SK همسانه‌سازي و ترادف نوكليوتيدي آن تعيين (توسط شركت SeqLab آلمان) شد. هم‌ساني ترادف‌ها با ترادف‌هاي بانك ژن نشان دهنده حضور ويروييد كوتولگي رازك در نمونه‌هاي آلوده بودند. از آنجايي كه علايم اين بيماري در بيشتر درختان مركبات نظير نارنگي‌هاي انشو، كلمانتين و محلي در شمال ايران مشاهده شده است، احتمال دارد بيشتر درختان مركبات شمال ايران به عامل بيماري كاككسياي مركبات آلوده باشند. ترادف نوكليوتيدي ويروييد كوتولگي رازك همراه با بيماري كاككسيا براي اولين بار در ايران تعيين شد.

Cachexia is a viroid disease of citrus worldwide. Field symptoms of cachexia including stunting, chlorosis, decline, gumming of the bark and stem pitting have been observed on many Satsuma (Citrus unshiu) and Clementine (C. reticulata) and some sweet orange trees in Mazandaran. In 2004, eight Satsuma and Clementine samples were collected from symptomatic trees in eastern Mazandaran. Young leaves and bark tissues were used for RNA extraction. Reverse transcription-polymerase chain reaction was performed using viroid specific primer pairs of Hop stunt viroid, Citrus bent leaf viroid, Citrus exocortis viroid, Citrus viroid III, Citrus viroid IV and coat protein gene (CP25) of Citrus tristeza virus. The expected HSVd 300bp fragment was observed on 1.5% agarose gels following electrophoresis. Single-strand conformation polymorphism analysis differentiated the isolates into two groups. The amplified products from a representative of both groups were ligated into pBluescript SK and one clone of each was sequenced using M13 primers. Alignment of the nucleotide sequences of the isolates with those deposited in GenBank revealed their highest identities with other isolates of Hop stunt viroid. As the symptoms of citrus cachexia disease have been observed in almost all citrus trees sampled, it appears that the majority of citrus trees in northern Iran are infected with the HSVd. This is the first report on the molecular characterization of Hop stunt viroid in citrus cachexia disease from Iran.