افزايش بيان گيرنده آنتي‌ژن كايمريك بر سطح لنفوسيت‌هاي T به كمك الحاق ژنومي

High-expression of chimeric antigen receptor on T lymphocytes by genomic insertion

چكيده سابقه و هدف فعال‌سازي اختصاصي سيستم ايمني به ويژه لنفوسيت‌هاي T ، يكي از اهداف اساسي در حوزه ايمونوتراپي سرطان است. به منظور القاي سلول‌هاي ايمني فرد بيمار، از گيرنده‌هاي كايمريكي كه حاوي خاصيت اتصال ويژه به آنتي‌ژن‌ها هستند، استفاده شده است تا لنفوسيت‌هايT سيتوتوكسيك را فعال كنند. گيرنده كايمريك، متشكل است از قسمت متصل شونده به آنتي‌ژن از آنتي‌بادي كه از طريق يك مولكول اتصال‌دهنده خارج سلولي به ناحيه داخل غشايي و نيز دومين‌هاي سيتوپلاسمي شروع كننده سيگنالينگ لنفوسيتي متصل مي‌باشد. هدف از اين بيان پايدار و افزايش يافته CAR (Chimeric Antigen Receptor) بر سطح سلول‌هاي T ، فعال شدن موثر سيستم ايمني بر عليه سلول‌هاي توموري بود. مواد و روش‌ها در يك مطالعه تجربي، نواحي متغير آنتي‌بادي‌هاي زنجيره سنگين شتري(VHH يا نانوبادي) به جاي قسمت هدف گيرنده آنتي ژن در ساختار گيرنده كايمريك استفاده شد. براي بيان پايدار و افزايش يافته گيرنده كايمريك حاوي VHH، از سيستم اينتگراز PhiC31 به منظور الحاق ژن گيرنده كايمريك در داخل ژنوم سلول‌هاي T استفاده شد. سازه‌هاي بيان‌كننده گيرنده‌هاي كايمريك و اينتگراز PhiC31 به داخل رده سلولي Jurkat ، كوترانسفكت گرديدند و بيان گيرنده‌هاي كايمريك در روزهاي اول و سي‌ام بعد از ترانسفكشن، با روش semi-quantitative RT-PCR اندازه‌گيري شد. يافته‌ها نتايج تحقيق در روز سي‌ام نشان داد كه كوترانسفكشن سازه‌هاي بياني اينتگراز فاژ PhiC31 و سازه‌هاي حاويCAR ، منجر به بيان پايدار و افزايش يافته اين گيرنده‌ها مي‌شود. نتيجه گيري بر اساس نتايج تحقيق، آنزيم اينتگراز PhiC31 ، قابليت استفاده در ايمونوتراپي به واسطه سلول‌هاي T حاوي گيرنده كايمريك را دارد.

Abstract Background and Objectives The specific activation of the immune system especially T lymphocytes has been a long-term goal of cancer immunotherapy. In an approach to induce the patient’s own immune cells, chimeric antigen receptors (CAR) were used to activate cytotoxic T lymphocytes. The CAR consists of an antigen binding domain of antibody molecule linked through an extracellular linker to transmembrane and cytoplasmic domains of lymphocyte-triggering moieties. Materials and Methods In our research group, variable domains of heavy chain antibodies (VHH or nanobody) derived from camelids were used instead of the antigen-binding domain in chimeric receptors constructs. To obtain a stable and increased expression of VHH harboring CAR, the PhiC31 integrase system was used for CAR gene integration into the T-cell genome. Constructs expressing CAR and PhiC31 integrase were co-transfected into the Jurkat cell line and CAR expression was quantified after one day and 30 days after transfection by a semi-quantitative RT-PCR method. Results Our results on day 30 confirmed that co-transfection of PhiC31 integrase constructs and CAR expressing constructs resulted in stable and high expression of the receptors. Conclusions Based on our results, we conclude that PhiC31 integrase enzyme can be used for immunotherapy of cancer mediated by T cells expressing chimeric recetors.