تشخيص مولكولي ويروس حلقه زرد گوجه فرنگي در آلسترومريا در استان خراسان رضوي

Molecular Diagnosis of Tomato Yellow Ring Virus (TYRV) on Alstroemeria in Khorasan Razavi Province, Iran

در پاييز 1388، در يكي از گلخانه هاي كشت آلسترومريا (Alstroemeria sp.) (خراسان رضوي-مشهد)، علايم شبيه آلودگي هاي توسپوويروسي (به صورت نكروز) بر روي برگ، ساقه، دمبرگ و گل برخي گياهان مشاهده گرديد. از گياهان آلوده عصاره گيري شده و اين عصاره به تعدادي گياه محك تلقيح گرديد. بر روي اطلسي (Petunia hybrida) و سلمه (Chenopodium quinoa) علايم آلودگي به صورت زخم هاي بافت مرده موضعي ظاهر شد. علايم آلودگي بر روي تاتوره (Datura stramonium) و Nicotiana benthamiana ابتدا به صورت زخم هاي بافت مرده موضعي بوده و سپس علايم بافت مردگي سيستميك ظاهر گرديد. بر روي N. glutinosa. نيز لكه هاي بافت مرده سيستميك مشاهده شد. تلقيح مكانيكي آلسترومريا با عصاره تهيه شده از نمونه هاي آلوده آلسترومريا، ناموفق بود. با استفاده از آنتي بادي تهيه شده بر عليه نوكليو پروتيين (Nucleoprotein; N) ويروس هايTomato spotted wilt virus(TSWV)، Tomato yellow ring virus(TYRV)،Iris yellow spot virus(IYSV)، Impatiens necrotic spot virus(INSV)، Groundnut bud necrosis virus(GBNV)، Tomato chlorotic spot virus(TCSV)، Groundnut ring spot virus(GRSV) و Chrysanthemum stem necrosis virus(CSNV)، نمونه هاي آلوده با آزمون الايزا (DAS-ELISA) مورد بررسي قرار گرفته و نتايج نشان داد كه اين نمونه ها به TYRV آلوده هستند. به منظور بررسي نمونه ها با آزمون RT-PCR، RNA كل از N. benthamiana كه علايم آلودگي داشتند، با استفاده از تريزول استخراج گرديد. در نتيجه آزمون PCR با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي براي تكثير ژن N ويروسTYRV، يك قطعه DNA در حدود 805 جفت باز تكثير گرديد. توالي آمينواسيدي اين قطعه، پس از تعيين، در GenBank با رس شمارHQ154130(Accession number) ثبت گرديد. اين توالي با توالي آمينواسيدي پروتيين N توسپوويروس هاي موجود در GenBank مقايسه گرديد و مشخص شد كه 99 درصد با توالي آمينواسيدي پروتيين N ويروسTYRV از استان هاي فارس (رس شمار ABH07703)، تهران (رس شمارAAV98587) و مركزي (رس شمارACT09488) شباهت دارد. به منظور تعيين استرين ويروس، از پرايمرهاي اختصاصي در آزمون RT-PCR استفاده گرديد و مشخص شد كه اين جدايه، استرين گوجه فرنگي ويروسTYRV است. همچنين، اين ويروس با استفاده از Thrips tabaci از تاتوره هاي آلوده به سالم منتقل گرديد. اين اولين گزارش از آلودگي يك گياه تك لپه (آلسترومريا) به TYRV مي باشد.

In October 2009, in one of the alstroemeria (Alatroemeria sp.) greenhouses, located in Khorasan Razavi province, tospovirus-like symptoms (necrosis) were observed on stems, petioles, flowers and leaves of some plants. Sap extracts from these plants were mechanically inoculated to indicator plants. Necrotic local lesions were observed on Petunia hybrida and Chenopodium quinoa. Necrotic local lesions followed by a systemic necrosis that caused the death of the plants were observed on Datura stramonium and Nicotiana benthamiana. On inoculated N. glutinosa plants, systemic necrotic spots were developed. Mechanical backinoculation on alstroemeria was failed. Leaves of symptomatic plants were tested for Tomato yellow ring virus (TYRV), Iris yellow spot virus (IYSV), Tomato spotted wilt virus (TSWV), Impatiens necrotic spot virus (INSV), Groundnut bud necrosis virus (GBNV), Groundnut ring spot virus (GRSV), Tomato chlorotic spot virus (TCSV) and Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV) with antisera specific to the viruses (raised against nucleocapsid protein) in double-antibody sandwich-ELISA. The reaction with antisera specific to TYRV was positive. Total RNA was extracted from the infected N. benthamiana plants for reverse transcription-PCR amplification with TYRV specific primers which amplified a fragment near 805bp band covering the nucleocapsid protein gene. This fragment was sequenced (Acc. No. HQ154130) and showed 99% amino acid sequence identity with TYRV from Fars (Acc. No. ABH07703), Tehran (Acc. No. AAV98587) and Markazi (Acc. No. ACT09488) provinces. To identify the virus strain, specific primers were used and TYRV-t strain was identified. Also the virus was transmitted from the infected D. stramonium plants to the healthy leaves of the host by Thrips tabaci. To our knowledge, this is the first report of natural infection of a monocotyledon plant by TYRV.