همسانه‌سازي و تعيين خصوصيات ژن دلتا سيكس دسچوراز (d6d)، از گياه گل گاوزبان ايراني (Echium amoenum)

فعاليت آنزيم دلتا-6- دسچوراز (d6d) در تعداد معدودي از ميكروارگانيزم‌ها و گياهان از جمله گونه‌هاي جنس Echium متعلق به تيره گل گاوزبان (Boraginaceae) ديده مي شود. اين آنزيم اسيدلينولييك و اسيد آلفالينولنيك را به‌ترتيب به اسيد گامالينولنيك و اسيد استياريدونيك تبديل مي‌نمايد. جداسازي ژن كدكننده آنزيم مزبور و استفاده از آن در مهندسي مسير بيوسنتز اسيدهاي چرب در گياهان زراعي، اطلاعات علمي و كاربردي ارزشمندي را بدست خواهد داد. در اين تحقيق، با هدف جداسازي و همسانه‌سازي ژن d6d از گياه گل گاوزبان ايراني (E. amoenum)، پس از استخراج RNA كل و ساخت cDNA از بذرهاي نارس گياه، قطعه كد‌‌كننده ژن با استفاده از آغازگرهاي طراحي شده بر اساس توالي آنزيم متناظر در گونه‌هاي خويشاوند، تكثير گرديد. قطعه تكثير شده به طول تقريبي bp 1350 در پلاسميد ناقل همسانه‌سازي (مثبت pBluescript SK( درج گرديده و پلاسميد نوتركيب به باكتري E. coli سويه آلفاDH5 منتقل شد. نتايج تعيين توالي نوكليوتيد، صحت همسانه‌سازي قطعه مورد نظر را تاييد نمود. توالي كد‌‌كننده آنزيم دلتا-6- دسچوراز در گل گاوزبان ايراني مشتمل بر 1347 نوكليوتيد كد‌‌كننده 448 آمينواسيد توصيف گرديد. اين توالي در سطح پروتيين از مشابهت 96 – 94 درصد با توالي آنزيم متناظر در ساير گونه‌هاي جنس Echium برخوردار بود. دمين هاي مورد انتظار سيتوكروم b5، دسچوراز اسيد چرب، موتيف‌هاي حفاظت شده غني از هيستيدين و موتيف HPGG همگي در توالي پروتيين ترجمه شده شناسايي شدند. همچنين ساختار ثانويه، مناطق ترانس‌ممبران و الگوي هيدروپسي توالي پروتيين ترجمه شده تعيين گرديد كه از مطابقت بسيار بالايي با گزارش‌هاي متناظر از گونه‌هاي خويشاوند برخوردار بود. بررسي خصوصيات عملكردي آنزيم كد‌‌شونده توسط ژن d6d كلن شده، مستلزم بيان در سيستم گياهي مناسب و بررسي كاركرد آن در سطوح بيوشيميايي و آنزيمي مي‌باشد. توالي كد‌‌كننده ژن دلتا-6- دسچوراز گياه E. amoenum در پايگاه NCBI با شماره دسترسي GU237486 ثبت گرديد.

Delta-6 desaturase (D6D), an enzyme of a lipid methabolic pathway, has been found as active form in some microorganisms and plants like different species of the genus Echium from family Boraginaceae. The enzyme converts essential fatty acids linoleic acid and ?-linolenic acid into long-chain polyunsaturated ones, ?-linolenic acid and stearidonic acid, respectively. In this research, to isolate the d6d gene from Iranian borage (Echium amoenum), we followed total RNA isolation from immature seeds, total cDNA synthesis and PCR amplification using the gene specific primers designed according to the sequence of d6d in the other Echium species. Approximately a 1350 bp amplified fragment was inserted into the vector pBluscript SK(+) and cloned in Escherichia coli strain DH5?. Nucleic acid sequence analysis of the cloned fragment verified the successful isolation and cloning of the full length CDS of d6d gene from E. amoenum. The cloned CDS include 1347 nucleotides coding for 448 amino acids. The translated protein possessed high similarity of 94–96% to its counterparts previously reported in other Echium species. All the expected domains, i.e., cytochrome b5, fatty acid desaturase, HPGG motif and histidine rich conserved motifs were found in the sequence of translated protein. Furthermore, secondary structure, transmembrane domains and the hydropathy profile of the protein were highly similar to its counterparts in the other Echium species. The d6d gene is a promising gene to engineer the fatty acid metabolism in crop plants. Gene expression studies are necessary for further characterization of the cloned gene and its encoded enzyme. The sequence of the coding region of d6d gene from E. amoenum was submitted to GenBank under the accession number GU237486.