عوامل موثر در انتقال ژن گزارشگر uidA با استفاده از اگروباكتري به گياه كاهو (Lactuca sativa L.)

Factors Affecting Agrobacterium-Mediated Transformation of UidA Gene into Lettuce (Lactuca sativa L.)

گياه كاهو با توجه به نوع مصرف و وزن تازه آن از پتانسيل مطلوب به عنوان يك بيوراكتور جهت توليد پروتيين‌هاي نوتركيب و واكسن‌هاي خوراكي برخوردار است. پيش نياز نيل به اين هدف، بهينه‌سازي مسير كشت بافت و انتقال ژن به اين گياه است. براي بهينه‌سازي انتقال ژن با كمك اگروباكتري (Agrobacterium tumefaciens) به كاهو از ناقل دو تايي pBI121 كه داراي ژن گزارشگر gus تحت كنترل پيشبرنده CaMV 35S و ژن گزينشگر npt II با پيشبرنده NOS استفاده شد. در آزمايش اول دو رقم گياه كاهو (TN-96-41، TN-96-39) و دو سويه اگروباكتري (LBA4404 و C58) با تراكم هاي (OD600nM) 4/0 و 6/0 و سه سطح 0، 100 و 150 ?M/L استوسرنگان و سه زمان تلقيح 2، 4 و 7 دقيقه و با سه تكرار در قالب طرح فاكتوريل به كار گرفته شد. نتايج نشان داد كه رقم TN-96-39 و سويه باكتري LBA4404 براي عمل تراريختي مناسب‌تر بودند. در تيمار غلظت‌هاي مختلف اگروباكتري و سطوح مختلف استوسيرنگان تفاوت معني‌داري مشاهده نشد. زمان تلقيح 2 دقيقه نسبت به دو سطح ديگرتلقيح، نتايج بهتري را نشان داد. با توجه به نتايج بدست آمده از آزمايشات فوق، آزمايش ديگري با رقم TN-96-39 و سويه باكتري LBA4404 و تلقيح به مدت 2 دقيقه بر روي لپه‌هاي سه روزه و برگ‌هاي يك ماهه و جوانه‌هاي برگي جدا شده از سطح جنين‌هاي سوماتيكي در قالب يك طرح كاملاً تصادفي با سه تكرار انجام شد. نتايج نشان داد كه جوانه‌هاي برگي و لپه‌ها براي عمل انتقال ژن مناسب مي‌باشند كه به ترتيب 23% و 19% ريزنمونه‌ها بر روي محيط انتخابي قادر به رشد بودند. ارزيابي حضور ژن‌هاي gus و npt II در گياهان تراريخته در نسل‌هاي T0 و T1 از طريق PCR و آزمون بيان ژن gus نشان داد كه حداقل يك نسخه از ژن gus در ژنوم گياه جا گرفته و بيان يافته است

As regards the kind of use and production of biomass, lettuce benefits from a potential of acting as a bioreactor in producing recombinant proteins as well as edible vaccines. For the propose, one needs to optimize tissue culture and gene transformation in Lactuca sativa. Seeds of two cultivars TN-96-39 and TN-96-41 were disinfected in a solution of 2.5% sodium hypochlorite containing 0.1% Tween 20 for 25 minutes. This was followed by three rinses of sterile distilled water. The seeds were then germinated in Petri dishes on filter paper soaked with sterile distilled water. The cultures were continuously exposed to white fluorescent light at a constant temperature of 25oC, for a minimum of 16 hours. When aseptically germinated seedlings were 48 to 72 hours old, cotyledons were excised near the cotiledonary node, and cut into either 6 or 8 pieces to expand the already existing wound on the explants for callus growth. The most suitable growth regulators for callus production and embryogenesis were 0.05 mg/l NAA, and 0.2 mg/l BA. The most appropriate growth regulator for direct regeneration and proliferation was found out as 0.05 mg/l NAA, 0.4 mg/l BA. To produce roots, shoots were transferred to MS medium culturing 0.2 mg/l of NAA. Strong root bearing plantlets were planted in pots to produce seeds. Transgenic plants of lettuce cultivars (TN-96-39, TN-96-41) were produced by use of Agrobacterium tumefaciens vectors containing the B- glucuronidase (GUS) reporter gene and the nptII gene for kanamycin resistance as a selectable marker. High frequency of transformation based on kanamycin resistance and GUS expression, was obtained with 72-h-old cotyledon explants cocultivated for 48 h with Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 & 2 minute dive for infection at cultivar TN-96-39. Progenies of T0 and T1 plants along with PCR & assay demonstrated linked monogenic segregation for kanamycin resistance and for GUS activity.