طراحي و ساخت پلاسميد حاوي ژن‌هاي “هر2” و “جي.پي 96” به شكل فيوژن وبيان آن با استفاده از ژن كد كننده پروتيين سبز فلورسنت

Designation and Construction of a Plasmid Containing gp96 and Her2 and in vitro Expression using GFP Gene

واكسن‌هاي“ دي.ان.اي”3 كه با استفاده از ژن “هر2” تاكنون طراحي و در مدل‌هاي آزمايشگاهي استفاده شده‌اند موفقيت نسبي داشته‌اند. اين امر نياز به افزايش پتانسيل اين واكسن‌ها را نشان مي‌دهد. شواهد موجود حاكي از اين است كه ملكول‌هاي شوك حرارتي4 ادجونت‌هاي قوي در ايمني درماني تومور هستند. اين ملكول‌ها قسمت‌هاي مختلف سيستم ايمني ذاتي و اختصاصي را تحت تاثير قرار مي‌دهند. در اين پژوهش از گليكوپروتيين 96 (عضو خانواده خانواده پروتيين‌هاي شوك حرارتي 90) به دليل خاصيت ادجونتي آن استفاده شد و اين پژوهش با دو هدف انجام شد: اوّلاً توليد ساختار ژنتيكي (پلاسميد) واجد هر دو ژن “هر2” و “جي.پي96” به شكل فيوژن و ثانياً بررسي بيان ساختار توليد شده با استفاده از ژن كد كننده پروتيين سبز فلورسنت5. به اين منظور، انتهاي C6 ژن “جي.پي96” به قسمت خارج سلولي و بين غشايي ژن “هر2” در پلاسميد “پي.سي. دي.ان.اي.3”7 متصل و تحت عنوان پي.سي تي/هر2 نام‌گذاري شد. ژن “جي.اف. پي” در پايي ن دست اين دو قسمت كلون شد كه تحت عنوان “پي.سي تي/هر2/جي.اف.پي”8 نام‌گذاري شد تا بيان اين ساختار در شرايط “اين.ويترو”9 بررسي شود. هضم آنزيمي بر روي محصول اتصال دو ژن “هر2” و “جي.پي96” نشان‌گر كلون شدن دو ژن به شكل متصل به هم بود. سپس، پلاسميد پي.سي تي/هر2/جي.اف.پي با استفاده از پلي فكت به داخل سلول‌هاي “هك.293 تي”10 منتقل شدند. بررسي ميكروسكوپي سلول‌هاي “هك.293 تي” نشان داد كه اين سلول‌ها رنگ سبز فلورسنت توليد مي‌كنند در حالي كه سلول‌هاي حاوي پلاسميد بدون ژن رنگ سبز فلورسنت را توليد نكردند. نتايج اين پژوهش حاكي از طراحي و بيان موفق ساختار است زيرا توليد رنگ سبز فلورسنت نشان‌گر قابل بيان بودن ساختار ژني حاوي دو ژن “هر2” و “جي.پي96” بود. ضمناً امكان بررسي توليد قسمتي از پروتيين “هر2” به صورت فيوز شده به “جي.پي96” با استفاده از ژن “جي.اف.پي” كه در مقايسه با روش‌هاي متداول مانند وسترن بلات11 و يا “آر.تي- پي.سي.آر” 12 روشي ساده و اررزان است، نشان داده شد. واكسن “دي.ان.اي” ايي آماده شده در اين پژوهش قابل استفاده در ايمني درماني مدل‌هاي توموري “هر2” مثبت است

Objective: DNA vaccinations using Her2 gene have shown some success in immunotherapy of Her2-expressing tumors, but the potency needs to be greatly enhanced. Heat Shock Proteins (HSPs) have shown to be potent adjuvant in immunotherapy of tumors and affect different aspects of innate and adaptive immune responses. We utilized the adjuvant effect of gp96 and attempted to gain two aims, firstly, production of a construct containing fusion of Her2 and gp96, and secondly, investigation of gene expression in the construct using green fluorescent protein (GFP) gene. Materials and methods: C- terminus of gp96 gene was linked to extracellular and transmembrane (ECD+TM) domain of Her2/neu within pcDNA3, named as pGP/Her2. GFP gene was cloned at the end of the two genes, named as pGP/Her2/GFP, for the analysis of in vitro gene expression. Subsequently, HEK 293T cells were transfected with pGP/Her2/GFP using polyfect. Results: Restriction endonuclease digestion confirmed the fidelity of the constructs. Microscopic view of the HEK 293T cells transfected with pGP/Her2/ GFP showed GFP protein production, while negative control cells transfected with pcDNA3 did not. Conclusions: The constructs were successfully developed, as GFP production showed that the genes located before GFP gene in the construct can be expressed. In addition, it was shown that in comparison with the currecnt methods (such as western blot and RT-PCT), investigation of gene expression using GFP gene is a simple method with lower cost. The construct could be used in immunotherapy of Her2-positive tumor animal models.