استاندارد سازي روش تشخيص مولكولي ent D استافيلوكوكوس آريوس جدا شده از عفونت‌هاي انساني و تعيين سكانس آن

Standardization of the Molecular Method for Detection of the ent D in Staphylococcus Aureus Isolated from Human Infections: and Sequence Determination

زمينه و هدف: انتروتوكسين D استافيلوكوكوس به عنوان يك سوپر آنتي‌ژن توسط نمونه‌هاي عفوني منابع انساني و حيواني توليد مي‌گردد. هدف اين تحقيق استاندارد سازي روش تشخيص استافيلوكوكوس توليد كننده‌ي انتروتوكسين D ‌بود. روش‌ بررسي: روش PCR جهت تشخيصent D در استافيلوكوكوس آريوس‌هاي جدا شده از نمونه‌هاي انساني (310 سويه جدا شده) Set up گرديد. محصول PCR خالص سازي و تعيين سكانس شد. سكانس حاصل Blast گرديد. همچنين، توانايي توليد انتروتوكسين D تمام سويه‌هاي ناقل ent D نيز با كيت اليزا بررسي شدند. يافته‌ها: نتايج نشان داد، روش مولكولي PCR به خوبي Set up شده است. زيرا، در يك مرحله پرايمرهاي مورد استفاده دو باند تكثير شدند، يكي در محدوده‌ي bp 1400 و ديگري در محدود‌ه‌ي bp 700 بود. هر دو باند از روي ژل جدا و تعيين سكانس شدند. مقايسه‌ي سكانس حاصل از باند bp 700 با سكانس ژن استاندارد موجود در بانك ژن انطباق 99 درصد را نشان داد. نتايج حاكي از آن بود كه ent D در محصول bp 700 قرار داشت. چنان‌كه Multiple Alignment سكانس حاصل با سكانس ژن استاندارد مقايسه و تاييد گرديد. توكسين‌زايي سويه‌هاي ناقل ent D با آزمون اليزا تاييد گرديد. نتيجه‌گيري: بر اساس اطلاعات موجود، در حال حاضر سويه‌هاي استافيلوكوكوس آريوس كواگولاز مثبت در نمونه‌هاي باليني مورد توجه قرار مي‌گيرند. اما روشي جهت نشان دادن توانايي توليد انتروتوكسين‌ها از جمله انتروتوكسين D وجود ندارد. تحقيق حاضر روشي ساده و سريع جهت تاييد توانايي توكسين‌زايي باكتري را ارايه و تشخيص سويه‌هاي توليد كننده‌ي انتروتوكسين D را استاندارد سازي نموده است.

Background and Objectives: Staphylococcal enterotoxin D as a supper antigen is produced by infected samples of human and animal sources. The aim of this study was to standardize the detection methods for the Staphylococcus strain producing enterotoxin D. Materials and Methods: A PCR method was set up for detection of enterotoxin D gene (ent D) in Staphylococcus aureus samplesisolated from the human subjects (310 strains isolated from clinical samples). The specific PCR-product (a band about 700 bp) was purified and sent off for DNA sequencing. Blast analysis showed a 99% identity with the standard gene sequence from Genebank. The ability to produce enterotoxin D by all strains carrying ent D was analyzed by using an ELISA kit. Results: The results of this study show that the PCR method has been well set up. There were two PCR products obtained by the primer pair, one at 700 bp and another at 1400 bp. Both bands were gel purified and sent for DNA sequencing. The results, based on the alignment with the standard ent D sequences from GenBank, suggest that ent D is contained within the 700-bp product. Production of the entrotoxin D in the positive strains was confirmed by ELISA. Conclusion: Based on the available information, coagulase positive Staphylococcus aureus strains are recorded in clinical samples. However, there is no routine method available to analyze the ability of the bacterial strains for producingtoxins including enterotoxin D. This study represents a simple, fast, and standard method for verification of the bacteria enterotoxin D and the strains producing it. Keywords: Staphylococcus aureus, ent D, PCR