شناسايي و كلون‌سازي خانواده ژني چالكون سنتاز گياه خار مريم (Silybum marianum L.)

Identification and cloning of chalcone synthase gene family in milk thistle (Silybum marianum L.) plant

سيلي مارين يك تركيب فلاونوييدي است كه از دانه‌‌هاي گياه خارمريم به دست مي آيد و داراي خواص دارويي متعددي مي‌باشد. چالكون سنتاز نقش كليدي در مسير بيوسنتزي فلاونوييدها دارد بنابراين شناسايي ژن رمزده آن گامي مهم در مهندسي متابولوم گياه خارمريم مي‌‌باشد. بدين منظور پس از جمع‌آوري داده‌هاي توالي موجود در مورد خانواده ژني چالكون سنتاز در ساير گياهان، همرديفي آن ها و تعيين نواحي حفظ شده، چهار آغازگر دژنره بر اساس اين نواحي طراحي شد. قطعات ژني تكثير شده در PCR با استفاده از اين جفت آغازگر از ژنوتيپ بومي منطقه برازجان و رقم اصلاح شده مجار در ناقل مناسب همسانه‌سازي و سپس تعيين توالي شدند. مطالعه توالي نوكليوتيدي حاصل و توالي اسيدآمينه‌اي آن ها، منجر به شناسايي دو عضو از خانواده ژني چالكون سنتاز در اين گياه گرديد. بر اساس نقاط متنوع، شش آغازگر اختصاصي براي هريك از اعضا جهت تكثير cDNA از روي RNAي كل رقم مجار درسيستمRACE طراحي شد. قطعات cDNAي تكثير شده در3ʹRACE و5ʹRACE در ناقل مناسب همسانه سازي و سپس تعيين توالي شدند. توالي كامل cDNAي ژن چالكون سنتاز از همپوشاني توالي هاي5ʹRACE و 3ʹRACE عضو يك شناسايي گرديد كه قالب باز خواندني آن داراي 1239 باز بوده و شامل اگزون يك (190 باز) و اگزون دو (1049 باز) مي‌باشد كه به ترتيب 63 و 349 اسيدآمينه را رمز مي كنند. مطالعه كل توالي‌هاي نوكليوتيدي و اسيدآمينه‌اي به دست آمده، منجر به شناسايي سه عضو از خانواده ژني چالكون سنتاز در اين گياه براي اولين بار شد كه داراي دومين هاي حفظ شده انتهاي آمين و كربوكسيل چالكون سنتاز مي‌باشند.

Silymarin is a flavonoid compound derived from milk thistle plant (Silybum marianum) seeds comprising several pharmacological applications. chalcone synthase (CHS) is a key enzyme in the biosynthesis of flavonoids, thereby identification of CHS gene in milk thistle plant can be of great importance. Seeking that, the available sequences of CHS genes from different plants collected, aligned and the conserved regions detected. Then, 4 degenerate primers designed based on the CHS consensus sequences. The fragments of CHS genes from Borazjanʹs native genotype and Majarʹs modified genotype were amplified by polymerase chain reaction and then, cloned and sequenced. Analysis of the resultant nucleotide and deduced amino acid sequences lead to identification of two different members of CHS gene family from Silybum marianum. 6 specific primers were designed based on the diverged regions of each member for amplification of related cDNA from majarʹs total RNA in the RACE system. Amplified fragment of cDNA in 3ʹRACE and 5ʹRACE were cloned and sequenced. Full length cDNA was identified by overlapping the 3ʹRACE and 5ʹRACE sequences of member 1 whose open reading frame contains 1239 bp including exon 1 (190 bp) and exon 2 (1049 bp) encoding 63 and 349 amino acid residues, respectively. Altogether, analysis of the resulting nucleotide and deduced amino acid sequences lead to identification of three different members of chalcone synthase from Silybum marianum containing the conserved chalcone synthase C-terminal and N-terminal domains.