توليد آمونياك آزاد توسط باكتري ها طي فرايند تثبيت ازت

Investigation of free ammonium production by bacteria in nitrogen fixation process

آمونياك يكي از منابع بسيار مهم نيتروژن براي گياهان و ميكروارگانيسم ها مي باشد. باكتري هاي تثبيت كننده ازت, نيتروژن ملكولي را توسط كمپلكس آنزيمي نيتروژناز1 به آمونياك تبديل مي كنند كه عمده اين آمونياك طي فرآيند جذبي2 آمونياك جذب سلول شده و ترشحي نمي باشد اما گزارش هايي موجود است كه در برخي از باكتري هاي جهش يافته ي تثبيت كننده ازت, ترشح آمونياك رخ مي دهد. در اين تحقيق توليد آمونياك طي فرايند تثبيت ازت در باكتري هاي وحشي تثبيت كننده ازت مورد بررسي قرار گرفت. ابتدا سويه هاي مختلف اين باكتريها شامل اگروباكتريوم3 پاني باسيلوس4، ريزوبيوم5، كلبسيلا اكسي توكا6 و ازتوباكتر7 از ريشه و خاك اطراف ريشه گياهان مختلف از جمله نخود, شنبليله, عدس, يونجه, لوبيا, گندم و برنج جداسازي شدند و سپس هركدام آنها در دو محيط كشت بدون منبع نيتروژن (ازتو باكتر براث) با دو منبع مختلف قندي شامل مانيتول و ساكارز كشت داده شدند و بعد از يك هفته توليد آمونياك در آنها توسط معرف نسلر8 مورد بررسي قرار گرفت. در مرحله بعدي 3 سويه از باكتري پاني باسيلوس(E, H, SH) كه داراي بهترين راندمان توليد بودند انتخاب شده و توليد آمونياك در يك سيستم طراحي شده ي ابتكاري در سه آزمايش مختلف شامل (i حالت خشك شده باكتري (بيومس خشك9) بدون حضور ماده غذايي (ii در محيط مايع و (iii به صورت تر (بيومس تر10) قرار گرفته بر روي محيط جامد اسلنت، به مدت طولاني (7 هفته) مورد بررسي قرار گرفت. در مرحله آخر توليد آمونياك در واكنش تثبيت ازت با توليد آمونياك طي واكنش آمونيفيكاسيون11 (توسط باكتري هاي غير تثبيت كننده ازت) با يكديگر مقايسه شد. نتايج نشان داد از بين كل 35 سويه جداسازي شده, فقط 7 سويه پاني باسيلوس قادر به توليد آمونياك در طي فرايند تثبيت ازت بودند (با ماكزيمم توليد 2/14 ميلي مولار در محيط ساكارز ازتو باكتر) و با كمك سيستم U شكل در سويه E پاني باسيلوس در حالت خشك شده بعد از يك هفته بيشترين مقدار توليد آمونياك ديده مي شود (22ميلي مولار). مقايسه توليد آمونياك در واكنش آمونيفيكاسيون و واكنش تثبيت ازت (توسط باكتري پاني باسيلوس) نشان داد كه توليد آمونياك در پاني باسيلوس هم به مقدار بيشتر و هم به مدت طولاني‌تري انجام مي‌شود. اهميت اين تحقيق توليد و جمع آوري گاز آمونياك به صورت كاملاً جداگانه با يك روش جديد و ابتكاري مي باشد.

Ammonium (NH3) is an important nitrogen (N) source for plants and microorganisms. Bacteria convert N2 to NH3 by nitrogenase complex in nitrogen fixation process and this NH3 is assimilated and not released. However, there are some reports that N fixation in some mutant bacteria may lead to NH3 secretion. In this study wild strains producers of NH3 through N fixation without use of any mutant, were investigated as there were few reports about them. So, NH3 production in different N fixing bacteria like Paenibacillus, Rhizobium, Azotobacter, Agrobacterium and Klebsiella oxytoca, isolated from soil and plant roots of alfalfa (Medicago sativa), lentil (Lens culinaris), bean (Phaseolus luntus), pea (Pisum sativum), wheat (Triticum aestivum) and rice (Oryza sativa) was analyzed. NH3 production was assayed with Nessler reagent from bacteria cultured in two nitrogen-free medium (with two different carbon source including sucrose and mannitol) for one week. In the next stage, three strains of Paenibacillus (E, H, SH) with the highest NH3 production were selected and by means of an innovative system, production of NH3 in three different experiments (dry biomass of bacteria without any medium, in broth medium and wet biomass of bacteria located on slant medium) was assayed until production approached none (7 week). In the last stage, NH3 production by these bacteria was compared with non-nitrogen fixing bacteria during the ammonification process. Results show that from the 35 different isolated strains, only Paenibacillus strains were able to produce NH3 during the process of N fixation and accordingly seven strains of Paenibacillus were isolated (14.2 mM at the highest). The results indicated that dry biomass of E strain of Paenibacillus produced the highest amount of NH3 in the first week (22 mM). Paenibacillus produced greater amount of NH3 and for a longer time in comparison with ammonifynig bacteria. This is a novel way for the production of free ammonium.