بررسي پايداري DNA اشريشيا كلي روي كارت نگهداري DNA براي انجام آزمايش‏هاي مولكولي

A Study of the Stability of Escherichia coli on DNA Banking Card (DBC) for Molecular Tests

هدف: براي نگهداري DNA ميكروارگانيسم‏ها از روش‏هاي سنتي نگهداري در دماي پايين 4،20- و80- درجه سانتي‏گراد استفاده مي‏شود. كارت DBC يك روش نوين نگهداري DNA در دماي اتاق است. پ‍‍ژوهش حاضر به‏منظور بررسي پايداري DNA باكتري و تعيين بهترين روش نگهداري DNA روي كارت نگهداري DNA طراحي شد. مواد و روش‏ها: از يك جفت آغازگر از قسمت حفاظت شده دومين 16 srRNA براي شناسايي اشريشيا كلي استفاده شد و چهار نوع مختلف نمونه باكتريايي شامل سوسپانسيون باكتري، DNA خالص باكتري به روش فنل- كلروفرم، باكتري ليز شده با بافر ليز كننده و DNA باكتري با روش جوشاندن تهيه و در روي كارت جداگانه ريخته و در دماي اتاق خشك شد. سپس در زمان‏هاي 3 ،5 و 7 ماه پايداري DNA باكتري اشريشيا كلي با دو روش مولكولي PCR مرسوم با تعداد 1، 2، 3 ديسك (به قطر 1 ميلي‏متر) به‏عنوان منبعي از DNA باكتري و Real-Time PCR بررسي شد. نتايج: DNA باكتري پس از هفت ماه روي يك ديسك از كارت نگهداري DNA پايداري خود را حفظ نمود و حتي يك پانچ از ديسك به‏عنوان منبع DNA كافي بود. اما نتايج بررسي حاضر نشان داد كه سوسپانسيون باكتري بهترين روش نگهداري طولاني مدت DNA باكتري روي كارت نگهداري DNA است. نتيجه‏گيري: در روش‏هاي سنتي نگهداري DNA، پس از منجمد و ذوب شدن DNA كيفيت آن كاهش مي‏يابد اما در روش كارت نگهداري DNA كيفيت DNA براي زمان طولاني‏تر حفظ مي‏شود و علاوه برآن اين روش مزايايي مانند آساني در كاركردن با نمونه، قيمت پايين، تخليص سريع‏تر و در نهايت كاهش آلودگي فردي و محيطي را دارد.

Objective: Traditional methods for storing microbial DNA samples use the low-temperatures of 4 °C, -20°C or -80 °C. The DBC Card is a new method of storing microbial DNA at room temperature. This study evaluates the stability and determine the best storing method of Bacterial DNA on the DBC card. Methods: In this study, we used a pair of primers from the conserved domain of 16srRNA designed to identify Escherichia coli. Four different types of samples we prepared: i) bacterial suspension, ii) bacterial DNA extracted by the phenol -chloroform method, iii) bacterial lysate with lysis buffer and iv) bacterial DNA produced by the boiling method. All four samples were spotted on separate DBC cards and dried at room temperature. After periods of 3, 5 and 7 months, Escherichia coli samples were checked for DNA stability with two molecular techniques, conventional PCR with 1, 2 and 3 disks as a source of bacterial DNA (1 mm diameter) and Real-Time PCR. Results: Data showed that DNA stability was maintained after 7 months on a DBC disk, even using only one disk as a DNA source. The bacterial suspension was the best method for long-term storage of Escherichia coli DNA on the DBC Card. Conclusion: In traditional methods for storing sample, DNA quality reduces after freezing and thawing. However in the DBC method, DNA quality was maintained for a long duration. Advantages of the DBC method are easy sample handing, low cost, faster extraction, and reduced individual and environmental contamination.