رديابي اختصاصي Phytopthora inundata از طريق واكنش زنجيره‌اي پليمراز ساده و تودرتو*‌‌

SPECIES-SPECIFIC DETECTION OF Phytophthora inundata BY SIMPLE AND NESTED-PCR *

گونه Phytophthora inundataبه تازگي توصيف شده و به علت خصوصيات ريخت شناختي و حداكثر دماي رشد غيرعادي، شناسايي آن دشوار است. اين گونه با ساير گونه هاي بيمارگر گياهي جنس Phytophthora كه بدون پاپيل و گرماپسند هستند، اشتباه مي شود. در اين بررسي براي شناسايي P. inundata شيوه اي براساس واكنش زنجيره اي پليمراز ساده و تودرتو ابداع شد. بدين منظور مجموعه اي از جدايه ها مربوط به ميزبان هاي مختلف كه نماينده تنوع موجود در توالي نواحي رمزگذار و فاقد رمزِ اين گونه بودند، مورد بررسي قرار گرفت. براساس توالي هاي جداكننده نسخه برداري شده داخلي يك و دو و ژن 8/5 اس مربوط به دي اِن اِي ريبوزومي (آي تي اِس)، ژن پروتيين مقاوم به شوك حرارتي 90، ژن هاي پروتيين پيوسته تريوزفسفات ايزومراز/گليسرآلدييد سه فسفات دي هيدروژناز و هم‌چنين ژن پروتيين 60 اس ريبوزومي ال 10، براي گونه مذكور ده عدد آغازگرِ واكنش زنجيره اي پليمراز اختصاصي طراحي گرديد. براي ايجاد بيشترين اختصاصيت و كارآيي، دماي جفت شدگي و زمان گسترش براي هر جفت آغازگر بهينه سازي گرديد. براي ارزيابي آغازگرها از 28 گونه ديگر فيتوفتورا كه از نظر ريخت شناختي و مولكولي تاييد شده بودند، استفاده شد. در اغلب موارد هيچ يك از مجموعه آغازگرها قادر به فزون سازي دي اِن اِي خالص سازي شده از گونه هاي Phytophthora غيرخودي نبودند. واكاوي ها نشان داد كه بهترين نامزد براي شناسايي جدايه هاي P. inundata مجموعه ITS-I1 مي باشد كه از تركيب آغازگرهاي ITS-IF1 و ITS-IF2 تشكيل شده است. دماي جفت شدگي بهينه براي اين مجموعه 69 درجه سانتي گراد و بهترين زمان گسترش 40 ثانيه مي باشد. به نظر مي رسد استفاده از واكنش زنجيره اي تودرتو با استفاده از مجموعه ITS-I1 به همراه آغازگرهاي عمومي ITS4 و ITS6 به عنوان آغازگرهاي خارجي حداقل 50 برابر حساس تر از روش سنتي است.

Phytophthora inundata has been recently described and depicted as a ‘difficult’ taxon for identification due to its morphology and unusually high upper temperature limit for growth which has been mistaken for other non-papillate and high temperature tolerant plant pathogenic Phytophthora species. A simple as well as a nested-PCR based method was developed for the identification of P. inundata. A collection of isolates from different hosts representing diversity of species were examined for unique regions of coding as well as non-coding gene sequences. Based on internal transcribed spacers 1, 2 and 5.8S gene of rDNA (ITS), heat shock protein 90 gene (HSP), triosephosphate isomerase/glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase fusion protein (TIG), and 60S ribosomal protein L10 gene (RPL) ten PCR primers specific for P. inundata were designed. Annealing temperatures and extension times were optimized for each set of primers for maximum specificity and efficiency. To evaluate the specificity of the method, 28 morphologically and molecularly characterized Phytophthora species were tested. In most cases neither set of primers amplified purified DNA from these non-homologous Phytophthora species. Analysis showed that the best candidate for identification of P. inundata isolates is ITS-I1 set which is a combination of ITS-IF1 and ITS-IR1. The optimized annealing temperature for this set was 69 °C and the best extension time was 40 sec. It seems that nested-PCR by ITS-I1 set together with universal ITS6 and ITS4 as external primers is at least 50 times more sensitive than conventional PCR.