همراهي توام چند ويروييد مركبات با علايم بيماري‌هاي پسوروز و نقش حلقوي در مركبات استان مازندران

SIMULTANEOUS ASSOLIATION OF SEVERAL CITRUS VIROIDS WITH PSOROSIS AND RING PATTERN SYMPTOMS IN CITRUS TREES IN MAZANDARAN PROVINCE

مركبات از محصولات باغي مهم و استراتژيك در كشاورزي ايران به شمار مي آيد. در بين استان‌هاي مركبات خيز ايران، استان مازندران بيشترين سطح زير كشت مركبات (حدود 100 هزار هكتار) و توليد و تنوع ارقام را به خود اختصاص داده است. تنوع ارقام وارداتي از يكسو و تكثير پيوندي نهال ها از سوي ديگر موجب بروز و انتشار بيماري‌هاي متعددي در اين منطقه شده است به‌طوري‌كه علايم بسياري از بيماري‌هاي ويروسي و شبه ويروسي در باغ‌هاي مركبات آن مشاهده گرديد. با وجود اين، عوامل احتمالي برخي بيماري‌هاي شبه ويروسي نظير نقش حلقوي (citrus ring pattern) در مركبات مازندران نامعين مانده و به‌كارگيري پيوندك هاي گواهي شده عاري از بيماري چندان مورد توجه عموم قرار نگرفته بوده است. اما در يك دهه اخير با شروع انتقال ويروس تريستزا توسط شته در مازندران، تمايل باغداران اين منطقه به استفاده از پايه هاي متحمل به تريستزا خصوصاً پونسيروس (Poncirus trifoliata) و دورگه هاي آن نظير سيترنج (P. trifoliata × Citrus sinensis) و سيتروملو (P. trifoliata × C. paradisi) و هم‌چنين استفاده از منابع پيوندك عاري از بيماري (بالاخص ويروس تريستزا) افزايش پيدا كرده است. در سوي ديگر، برخي باغداران و توليدكنندگان نهال هاي مركبات نسبت به اثر ويروييدهايي كه تاكنون در ارقام مركبات بر روي پايه نارنج بي اثر يا بي ضرر مانده اما در پايه هاي پونسيروس و دورگ هاي آن سبب كاهش اندازه و ميزان محصول مي گردند نگران گرديده اند. بررسي هاي مقدماتي انجام شده در زمينه رديابي ويروس پسوروز مركبات در درختان داراي علايم نقش حلقوي و پسوروز در شرايط باغ و در گياهان پيوند شده در گلخانه نتايج مثبتي در پي نداشته و محصول اختصاصي مربوط به ويروس پسوروز مركبات با PCR قابل تكثير نبوده است. با توجه به اهميت موضوع، به منظور رديابي ويروس و ويروييدهاي مولد يا همراه بيماري‌هاي پسوروز (scaly bark psorosis) و نقش حلقوي مركبات، پيوندك هايي از شاخه هاي آلوده نارنگي انشو (C. unshiu, Satsuma mandarin) تهيه و روي نهال يكساله بالنگ اتراگ (C. medica, Etrog) رقم Arizona 861-S1 و گياه دوساله پرتقال ناف دار واشنگتن (Washington navel) كه بر روي پايه نارنج تكثير شدند پيوند زده شد. گياهان پيوند خورده در شرايط گلخانه با دماي 30-22 درجه سلسيوس نگهداري و به‌صورت ماهانه جهت مشاهده علايم بازبيني مي شدند. علايم نقش ميخي در برگ‌هاي همه گياهان پيوندخورده با منبع پيوندك آلوده به پسوروز بعد از گذشت يك تا سه ماه مشاهده شد. رگبرگ روشني و خميدگي برگ در نهال هاي بالنگ اتراگ آلوده شده با پيوندك هاي نقش حلقوي مشاهده گرديد. نهال هاي پرتقال مايه‌زني شده با بيماري نقش حلقوي نيز نقوش خطي و حلقوي را پس از گذشت چهار سال از زمان پيوندزني نشان دادند. بعد از حدود يكسال، نمونه هاي آر ان ا از بافت هاي آلوده شده نهال هاي پرتقال و بالنگ اتراگ با استفاده از ماده ترايزول (TRIzol, Invitrogen) استخراج و در واكنش زنجيره اي پليمراز با نسخه برداري معكوس با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي ويروييدها و ويروس پسوروز مركبات مورد ارزيابي واقع شد. نتايج حاصل از الكتروفورز محصول RT-PCR بر روي ژل آگاروز 5/1% در حضور نمونه شاهد ويروييدهاي مركبات نمايانگر حضور ويروييدهاي خميدگي برگ، كوتولگي (ويروييد 3، قبلي)، ترك خوردگي پوست (ويروييد 4، قبلي) و ويروييد 6 مركبات (OS قبلي) و ويروييد كوتولگي رازك در نمونه هاي آلوده به بيماري‌هاي نقش حلقوي و پسوروز مركبات بودند. هيچ نواري از ويروييد اگزوكورتيس مركبات در نمونه هاي بررسي شده رديابي نشد. اين اولين گزارش از حضور همزمان ويروييدهاي مركبات همراه با بيماري‌هاي پسوروز و نقش حلقوي مركبات در ايران است.

Citrus is one of the most important fruit crops in Iran. Among the citriculture areas of Iran, Mazandaran province has the highest acreage (about 100,000 ha), production and number of varieties nationwide. Unauthorized importation of citrus species and cultivars and propagation by growers and nurserymen have led to perpetuation and spread of virus, viroid and other graft-transmissible pathogens of citrus in Mazandaran. Nonetheless, the putative agents of several of such graft-transmissible diseases including citrus ring pattern(CRP) have remained undetermined and the use of certified disease-free propagative stocks has not gained widespread attention. With the onset of the aphid transmission of Citrus tristeza virus (CTV) in the area, trend has shifted toward the use of CTV-tolerant rootstocks, mainly trifoliate orange (Poncirus trifoliata) and its hybrids, citranges (P. trifoliata × Citrus sinensis) and citrumelos (P. trifoliata × C. paradisi) with concurrent use of disease free (mostly CTV-free) budwoods and budlings. Some nurserymen and growers are becoming keen about the impact of several viroid species which have, herebefore, been regarded as harmless to orange and mandarins produced on sour orange(C. aurantium) rootstock but would adversely affect vigor and yield of trees on trifoliate orange and its hybrids. Preliminary attempts to detect viruses causing citrus psorosis and CRP diseases in symptomatic orchard trees and in plants graft-inoculated with the infected sources in the greenhouse, have remained unsuccessful and no amplicon specific for Citrus psorosis virus has been obtained in PCR trials thus far. In the present study, bark patches from twigs of Satsuma mandarin(C. unshiu) trees showing psorosis young leaf symptoms and those displaying CRP symptoms on mature leaves were budded onto one-year-old seedlings of Etrog citron(C. medica, Arizona 861) and sour orange and 2-year-old Washington navel sweet orange on sour orange rootstock. The budded plants were kept in the greenhouse at 22-30oC, and observed periodically for the appearance of symptoms. Leaf flecking appeared on all citrus plants inoculated with buds from the psorosis-infected trees within one to three months. Midvein browning and leaf epinasty developed on Etrog citron seedlings budded with bark strips from several of the CRP-infected trees. Sweet orange budlings started to show some ring and line patterns in three to four years after inoculation with two CRP sources. Sour orange seedlings remained symptomless up to the termination of the experiment(year 6). Ribonucleic acid(RNA) was extracted from both symptomatic sweet orange and Etrog citron plants with TRIzol reagent(Invitrogen, Paisley, UK) and subjected to Reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) using primers specific for CPV and citrus viroids in single PCR. The PCR products were electrophoresed on 1.5% agarose gels and stained with ethidium bromide. Bands representing those of citrus viroids including citrus bent leaf, hop stunt, citrus dwarfing, citrus bark cracking and citrus viroid VI were present in the Etrog citron and sweet orange plants inoculated with several sources of CRP and CP-like symptomatic Satsuma mandarin trees. Citrus exocortis viroid was not detectable in any sample tested. This is the first report on the simultaneous presence of multiple citrus viroids in citrus trees showing symptoms of psorosis and ring pattern diseases in Iran.