ترانسفكشن رده سلولي PC12 بوسيله وكتور بياني -NT4 pEGFPNIو بررسي بيان پروتييني آن

Transfection of PC12 cell line by pEGFPNI- NT4 and protein expression analysis

سابقه و هدف: يكي از تكنيك‌هاي پايه‌اي مهم براي مطالعه يك پروتيين اختصاصي در بيولوژي مولكولي، كلون كردن و بيان آن در سلول مي‌باشد. از جمله روشهاي منتقل كردن ژن، روشهاي غير ويروسي است كه كم‌هزينه‌تر، آسانتر و ايمنتر مي‌باشند. يكي از ژن‌هاي مهم كه كاربردهاي باليني فراواني دارد ژن NT4 است. اين ژن يكي از اعضاي خانواده نوروتروفيك است و در سلول‌هاي گليال سيستم اعصاب محيطي و مركزي بيان مي‌شود. اين نوروتروفين در بيان ژني، بقا و تمايز رده‌هاي مختلف نوروني شركت دارد. هدف از انجام اين پژوهش، ساب‌كلونينگ و ترانسفكت اين ژن به منظور مطالعه و دسترسي بيشتر با توجه به نياز به اين فاكتور نوروتروفيك در فعاليتهاي ژن درماني است. مواد و روشها: در اين تحقيق، ژن NT4 با روش PCR در پلاسميد pCMV-SPORT6كلون گشته و پس از آن در باكتري اشرشياكلي سوش DH5-? ترانسفورم شد. پلاسميد نوتركيب از باكتري ميزبان استخراج و ژنNT4 با استفاده از آنزيم Not I ,Sal Iاز پلاسميد جدا گرديد. در مرحله بعد پلاسميد براي پذيرش قطعه NT4 و انجام كلونينگ با آنزيم Hind III برش داده شد و ژن NT4 درون پلاسميد pEGFP-NI ساب‌كلون شد. محصول واكنش اتصال در باكتري فوق ترانسفورم و در محيط LB حاوي آمپي‌سيلين كشت داده شد. پلاسميدهاي نوتركيب با استفاده از كيت استخراج پلاسميد، از باكتري تخليص و در مرحله بعد در سلول PC12 ترانسفكت گرديد و در خاتمه بيان پلاسميد نوتركيبب با روشSDS PAGE ,western blotting مورد بررسي قرار گرفت. يافته‌ها: آناليز آنزيمي و تعيين توالي نشان داد پلاسميد ژن مورد نظر حاوي توالي صحيحي بوده و تطابق كامل با توالي ژن مورد نظر در بانك ژن دارد. در آناليز پروتيين‌هاي جدا شده از سلول‌هاي ترانسفكت شده با روش SDS-PAGE، باندي حدود 45 كيلودالتون مشاهده شد كه با آنتي‌بادي مونوكلونال در آناليز وسترن بلات مورد تاييد قرار گرفت. نتيجه‌گيري: اين پلاسميد به دليل ساختار صحيح، جهت انتقال به سيستم يوكاريوتي و ارزيابي بيان مناسب مي‌باشد.

Background and Aim: Cloning and expression in the cells is one of the most important basic techniques to study a specific protein in molecular biology. Among gene transfer methods, non-viral methods are less expensive, easier and safer to be implemented. NT4 is an important gene with miscellaneous clinical applications. This gene is a neurotrophic that induce survival, development and function of neurons as well as inducing differentiation of progenitor cells to form neurons. The aim of this study was to construct and transfect NT4 gene, in order to use it in research and gene therapy. Materials and Methods: NT4 gene was subcloned in plasmid pcmvsport6, using PCR; then it was transformed in Escherichia coli bacteria strain DH5-alpha. The recombinant gene was extracted and restriction enzymes by NOTI, SAII. The fragment gene was legated into the PEGFP-N1 plasmid. Then by restriction enzymes HINDIII, the recombinant was detected through gel electrophosis. In order to ensure that recombinant gene is correct, it was sended for sequencing. Cell culture was prepared and the recombinant plasmid was transfected. SDS page and western blotting were used for detection of protein expression. Results: Enzyme analysis showed that pcDNA had correct structure and sequencing, confirmed by 100% homology of the gene with reported alpha gene in Gene Bank. In the analysis of proteins isolated from transfected cells with SDS-PAGE, an approximately 45 kDa band was observed with monoclonal antibody which was confirmed by Western blot analysis. ‍Conclusion: This plasmid is able to transform to Eukaryotic system and is suitable for evaluation of translation due to its proper structure.