طراحي سيستم جديد و ايمن سنجش ميزان اثرات سايتوپاتيك HIV با استفاده از ويروس هاي HIV-1 با قابليت يك سيكل همانندسازي

Designing a Safe and Novel System for HIV Induced Cytopathic Assay Using Single Cycle Replicable HIV-1 Virions

زمينه و هدف: تحقيقات بسياري در زمينه يافتن داروهاي ضد ويروس HIV در حال انجام مي باشند. بررسي بر روي اين تركيبات نيازمند كار با ويروس زنده است كه خطرات زيستي فراواني براي كاربران دارد. لذا در تحقيق حاضر، يك سيستم جديد و ايمن سنجش ميزان اثرات سايتوپاتيك HIV با استفاده از ويروس هاي HIV-1 با قابليت يك سيكل همانندسازي (SCR) معرفي شده است. روش كار: ويروس هاي HIV-1 با قابليت يك سيكل زندگي، به وسيله ترانسفكشن در سلول هاي HEK293T توليد شدند. پلاسميدهاي pMD2G، pSPAX2 و pmzNL4-3 براي توليد ويروس استفاده شدند. سلول هاي هدف MT-2 با مقادير مختلف از ويروس SCR HIV-1 آلوده شدند. ميزان تشكيل سنسشيوم در ميان سلول هاي آلوده شده به وسيله شمارش زير ميكروسكوپ نوري بررسي شد. ميزان مرگ و مير سلول هاي آلوده شده به ويروس به وسيله سنجش ميزان تكثير سلولي با روش XTT بررسي شد. داروهاي نويراپين و اينديناوير به عنوان كنترل مثبت استفاده شدند. يافته ها: با افزايش ميزان ويروس شروع كننده آلودگي تا حد 1600ngP24، تعداد سنسشيوم در ميان سلول هاي هدف افزايش نشان داد. با افزايش ميزان ويروس به ميزان بالاتر توليد سنسشيوم در ميان سلول هاي MT-2 كاهش يافت. افزايش تعداد سنسشيوم تا سه روز پس از آلودگي مشاهده و سپس كاهش خود به خودي نشان داد. مرگ سلولي در ميان سلول هاي هدف با رسيدن ميزان ويروس شروع كننده به 1600ngP24 به حداكثر خود رسيد. ميزان توان 50% بازدارندگي اثرات سايتوفيت (IC50) محاسبه شده براي تركيب هاي BMS806 و نويراپين بر اساس روش ابداع شده در اين مطالعه به ترتيب 30 و 50 نانومولار بوده است. نتيجه گيري: با توجه به نتايج مطالعه امكان انجام بررسي اثرسايتوپاتيك HIV با استفاده از ويروس هاي SCR HIV وجود دارد. همچنين نتايج بررسي ميزان اثر ضد ويروسي دو داروي نويراپين و BMS806 نشان دهنده دقت اين روش براي سنجش اثر ضد HIV-1 تركيبات مختلف مي باشد. همانندسازي يك دوره اي SCR HIV باعث افزايش امنيت زيستي روش ابداعي در اين مطالعه نسبت به استفاده از ويروس ناميرا مي باشد.

Background & Objectives: Several studies have been conducted to explore anti-HIV drugs. Discovery and study of novel anti-HIV-1 compounds need live viruses and has serious biosafety concerns. In this research we reported a novel and safe system for assaying the cytopathic effects of HIV by using single cycle replicable (SCR) HIV-1 virions. Methods: To produce the SCR HIV-1 virions, pMD2G, pmzNL4-3 and pSPAX2 plasmids were co-transfected into HEK293T cells. Different amount of SCR virions were used to infect target cells (MT-2). Within the infected cells, the number of formed syncytia was counted under the light microscopy. The lethal effects of the SCR HIV virions were measured using XTT proliferation assay. Results: Formation of syncytia among SCR HIV infected cells was detectable 24 hours after infection. Highest amount of syncytia was seen 72 hours after infection. Increase in the amount of virions caused increasing of syncytia and the cytopathic effects of SCR HIV-1. Infection with more than 1600ng P24 SCR HIV decreased the syncytium formation and viability of all cells. The calculated IC50 (50 percent inhibitory capacity) for nevirapine and BMS806 using this method was 50nM and 30nM, respectively. Conclusion: SCR HIV-1 virions are replicable only for one cycle. Using these virions can improve the safety of HIV researches. Herein, we optimized the assaying of HIV induced cytopathic effects by using SCR HIV-1 (NL4-3) virions. The accuracy of this method was accepted by quantifying the anti-HIV-1 effects of nevirapine and BMS806 by (SCR) HIV-1 virions.