طراحي سازه‌هاي اگروباكتريومي به منظور توليد گياهان تراريخته مقاوم به شوري، خشكي و سرما فاقد نشانگر آنتي‌بيوتيكي

Design of Agrobacterium Constructs for Production of Antibiotic Free Transgenic Plants, Salt, Drought and Cold Resistant

در بيشتر مطالعات مرتبط با انتقال ژن به گياهان، از ژن‌هاي مقاومت به آنتيبيوتيك براي بازيابي گياهان تراريخته استفاده مي‌شود، اما معرفي چنين محصولاتي به درون زنجيره غذايي ممكن است نگراني‌هايي را از لحاظ ايمني‌زيستي منجر گردد. در اين تحقيق ژن بتايين‌آلدهيد دهيدروژناز (BADH) به عنوان يك نشانگر غيرآنتي‌بيوتيكي ايمن و با ارزش، در ساخت وكتورهاي اگروباكتريومي مناسب براي تراريزش گياهان مورد استفاده قرار گرفت. توالي ژن مذكور از منشا اسفناج از 6111 جفت باز با دربرداشتن چهارده اينترون، به 1494 جفت‌باز پس از حذف اينترون‌ها كاهش يافت و با تغيير توالي نوكليوتيدي بدون تغيير در اسيدآمينه، هشت جايگاه‌هاي آنزيمي داخلي ناحيه كدكننده اين ژن حذف گرديد. توالي قسمت كُد كننده ژن BADH كه با ناحيه بدون ترجمه ‘5 مربوط به T7gene10 فاژي همجوش شده و در وكتور پلاستيدي pB كلون‌سازي گرديده بود، طي مراحلي پس از هضم آنزيمي دوگانه، صاف نمودن انتهاي چسبنده قطعه، ايجاد كدون آغازين ATG و افزودن تك نوكليوتيد آدنين، ابتدا در ناقل اوليه pTZ57T/A كلون‌سازي شده و سپس در ناحيه T-DNAي دو حامل دوگانه اگروباكتريومي كلون‌سازي مجدد گرديد. دو حامل نوتركيب نهايي pBI-BADH و pBI(-k)BADH در اين تحقيق حاصل شدند كه ژن بتايين‌آلدهيد دِهيدروژناز را تحت پيشبر CaMV35S و پايانبر Nos دربر دارند. حامل pBI(-k)BADH فاقد هر گونه نشانگر آنتي‌بيوتيكي بوده و مي‌تواند به تنهايي براي تراريزش گياهان با هدف ايجاد مقاومت بالا به شوري، خشكي و سرما، مورد استفاده قرار گيرد. امكان كلون‌سازي كاست‌هاي ژني ديگر ايجادكننده صفات با ارزش در اين ناقل درنظر گرفته شده است كه استفاده از آن ها مي‌تواند به توليد گياهان تراريخته چندمنظوره عاري از نشانگر و فاقد نگراني‌هاي ايمني زيستي منجر گردد.

In most studies related to plants transformation, the antibiotic resistance genes are used for recovery of transgenic plants, but introducing such products into the food chain may lead to biosafety concerns. In this study, betaine aldehyde dehydrogenase gene (BADH) was used as a safe and valuable non-antibiotic marker for construction of Agrobacterium vectors suitable for plant transformation. This gene sequences from spinach decreased from 6111bp to 1494bp after splicing. Nucleotide sequences were changed for remove of eight internal restriction enzyme recognition sites that do not result in a change to the amino acid sequence of BADH protein. badh gene with 5ʹUTR of T7gene10 was cloned from pB plastid vector into pTZ57R/T vector. This cloning procedure was performed in several stages including enzymatic double digestion, sticky ends to blunt ends conversion, adding of ATG start codon and adding of A nucleotide in the ends of fragment. Then this fragment was Re-cloned from pTZ-BADH recombinant plasmid into T-DNA regions of two Agrobacterium binary vectors. Finally in this study two recombinant vectors were obtained, pBIBADH and pBI(-k)BADH, that containing badh gene under control of CaMV35S promoter and Nos terminator. pBI(-k)BADH vector is an antibiotic marker free vector that can be used for plant transformation in order to producing resistant plants against salt, drought and cold stresses.