بررسي ترانسفكت وكتورهاي نوتركيب آدنوويروسي فاقد ژن گزارشگر و تيتراسيون آن با روش‌هاي مولكولي: راهنماي عملي

Evaluation of non-reporter adenovirus vector transfection and its titration by molecular methods: a practical guide

چكيده سابقه و هدف خصوصيات بيولوژي آدنوويروس، آن را به وكتوري مناسب در تحقيقات پايه به عنوان ابزار انتقال ژن و هم چنين در درمان باليني بسياري از بيماري‌ها و واكسيناسيون مبدل كرده است. در اين مطالعه، ترانسفكشن آدنوويروس فاقد ژن گزارشگر و هم چنين تيتراسيون آن به وسيله روش‌هاي مولكولي مورد ارزيابي قرار گرفت. مواد و روش‌ها در يك مطالعه تجربي، پس از ساخت آدنوويروس نوتركيب، وجود ترانس ژن در سازه ژني با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي آن با روش PCR و هم چنين تعيين توالي ارزيابي شد. به منظور پايش ترانسفكشن، DNA استخراج شده از سلول‌هاي ترانسفكت شده با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي ترانس ژن با روش PCR مورد بررسي قرار گرفت. تيتر ويروس به روش Real-time PCR و با استفاده از آغازگرهاي تشخيصي بر روي DNA استخراج شده از ليزات ويروس تعيين شد. يافته‌ها وجود ترانس ژن در سازه ژني نوتركيب با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي ترانس ژن و هم چنين تعيين توالي تاييد شد. بررسي DNA استخراج شده از سلول‌هاي HEK 293A ترانسفكت شده، موفقيت كيفي ترانسفكشن را مورد تاييد قرار داد و هم چنين تعداد ذرات ويروس با استفاده از Real-time PCR حدود 107 × 5 در واحد حجم(ميلي‌ليتر) برآورد شد. نتيجه گيري با طراحي و مهندسي هدفمند آغازگر، مي‌توان موفقيت يا عدم موفقيت ترانسفكشن را به صورت كيفي در كار با وكتورهاي آدنوويروسي فاقد ژن گزارشگر، ارزيابي نمود. هم چنين با استفاده از روش Real-time PCR و به كارگيري روش‌هاي مناسب جداسازي ژنوم كامل ويروس از ليزات آن، از محدوديت‌هاي تيتراسيون كيفي آدنوويروس اجتناب ورزيد.

Abstract Background and Objectives Biologival features of adenoviruses have made them vectors of choice for gene transfer in basic research as well as in clinical treatment and vaccination. The key steps in the trasnsfer of adenovirus vector gene are transfection monitoring and viral titer determination. We investigated the transfection of non-reporter adenoviruses as well as viral titration using molecular methods. Materials and Methods In this experimental study, after the recombinant adenovirus vector construction, the presence of transgenes in gene construct was evaluated by PCR with transgene specific primers and sequencing. After calcium-phosphate transfection of the packaging cell line (HEK 293A), transfection was monitored by PCR using transgene specific primers (diagnostic and compound primers) to analyze DNA extracted from the transfected packaging cell line. The viral titer was determined by Real Time PCR (RT-PCR) using diagnostic primer to analyze DNA extracted from viral lysates. Results The presence of transgene in gene construct was confirmed by transgene specific primers and sequencing. Evaluation of DNA extracted from transfected packaging cells confirmed the efficiency of monitoring of transfection. The viral titer was estimated to be about 4 × 107 viral particles/ml by RT-PCR. Conclusions Careful primer design is the key to the efficient monitoring of non-reporter adenovirus vector transfection. The appropriate genomic purification and the use of RT-PCR technique would also avoid the disadvantages of functional titration of adenoviruses.