طراحي و ساخت وكتور پلاستيدي حاوي ژن BADH

Designing and Construction of a Plastid Transformation Vector Containing BADH Gene

نوروتوكسين هاي بوتولينوم (BONTs) توكسين هاي باكتريايي نيرومندي هستند كه در غلظت هاي فمتومولار با جلوگيري از آزاد شدن انتقال دهنده عصبي استيل كولين سبب ايجاد فلج عضلاني شل مي گردند. هر نوروتوكسين متشكل از يك زنجيره سبك 50 كيلودالتوني و يك زنجيره سنگين100 كيلو دالتوني است. ناحيه انتهاي كربوكسيلي زنجيره سنگين كه سبب اتصال نوروتوكسين به گيرنده هاي ويژه سطح سلولي مي گردد ناحيه اتصال دهنده نام گذاري شده است. اين ناحيه از توانايي ايمني زايي قابل ملاحظه اي نيز برخوردار است. در اين مطالعه ژن هاي نواحي اتصال دهنده ي نوروتوكسين تيپ هاي A و B به منظور توليد پروتيين نوتركيب كايمر به عنوان كانديد واكسن دو ظرفيتي به يگديگر متصل شدند. بدين منظور از ژن هاي صناعي نواحي اتصال دهنده ي نوروتوكسين هاي تيپ A و B در حامل بياني pET28a (+)استفاده شد. براي ژن ناحيه اتصال دهنده ي نورتوكسين بوتولينوم تيپ B پرايمر پيشرو حامل جايگاه برشي NcoI و پرايمر پيرو حامل جايگاه برشي NdeI طراحي گرديد. با استفاده از آنزيمpfu ، ژن ياد شده مورد تكثير قرار گرفت. در مرحله بعد برش آنزيمي محصولات PCR و ناقل نوتركيب حاوي ژن ناحيه اتصال دهنده ي نوروتوكسين بوتولينوم تيپ A با استفاده از آنزيم هاي NcoI و NdeI انجام شد. سپس با استفاده از آنزيم T4 DNA ligase الحاق ژن مورد نظر در ناقل pET28a (+) حاوي ژن ناحيه اتصال دهنده ي نوروتوكسين بوتولينوم تيپ A انجام گرفت. در مرحله آخر، حامل نوتركيب حاوي ژن كايمر به باكتري E.coli DH5? انتقال داده شد. نتايج PCR ، برش آنزيمي و تعيين توالي سازه ي نهايي بيانگر صحت اتصال دو ژن به يكديگر بود.

Botulinum Neurotoxins (BoNTs) are potent bacterial toxins that cause paralysis at femtomolar concentrations by blocking acetylcholine release in motor neurons. Each BoNT is composed of a 50 kDa light chain that acts as a metalloprotease, and of a 100 kDa heavy chain. The carboxy terminal domain of the Heavy Chain (HC) mediates binding to specific cell surface receptors. The HC domain has considerable immunogenicity without any significant toxicity. In this study, the BoNT/A& B-HC were joined together for producing a recombinant chimeric protein as a vaccine candidate. For this reason, the relative genes were synthesized in pET28a (+) expression vector separately. Then, appropriate primers were designed to amplify the BoNT/B-HC gene. The restriction sites for NcoI and NdeI endonuclease were placed at 5ʹ end of forward and reverse primers respectively. The PCR products were then digested whit NcoI and NdeI enzymes. At the same time, the construct of pET28a (+) –BoNT/A-HC gene was digested by the same enzymes. Then, these digested fragments were joined together by T4 DNA ligase. The recombinant construct then introduced into E. coli DH5? strain. Our enzymatic digestion, PCR amplification and sequencing of recombinant construct confirmed correct fusion of BoNT/B-HC and BoNT/A-HC genes.