بررسي اثر عصاره گياه شيرين بيان بر روند تنظيم ژن aflR و روند توليد آفلاتوكسين در قارچ آسپرژيلوس پارازيتيكوس به روش Real Time PCR

A Survey of the Effect of Licorice Plant Extract on aflR Gene Expression and Aflatoxin Production in Aspergillus Parasiticus via Real-time PCR

هدف: آفلاتوكسين در صنايع غذايي، دامپروري و حوزه پزشكي اهميت دارد و آسيب‏هاي اقتصادي فراواني را سبب مي‏شود. مطالعات زيادي روي عصاره‏ها و تركيبات گياهي براي كاهش رشد ميكروارگانيسم‏هاي مولد آفلاتوكسين، عدم توليد سم توسط اين ارگانيسم‏ها و سركوب نمودن ژن اصلي مولد اين توكسين يعني aflR در جريان است. از گياهاني داراي اهميت در طب سنتي ما كه آثار ضد ميكروبي از خود نشان داده، شيرين بيان است. هنوز گزارشي از آثار يا مكانيسم‏هاي اثر آن بر قارچ‏هاي آسپرژيلوس مولد آفلاتوكسين وجود ندارد. مطالعه كنوني به بررسي اثر عصاره شيرين بيان بر مهار رشد آسپرژيلوس پارازيتيكوس و بيان ژن alfR توسط اين ارگانيسم مي‏پردازد. مواد و روش‏ها: پس از كشت آسپرژيلوس پارازيتيكوس در محيط محرك توليد آفلاتوكسين، حداقل غلظت بازدارندگي از رشد قارچ تحت اثر عصاره شيرين بيان اندازه‏گيري شد. غلظت آفلاتوكسين در محيط‏هاي كنترل و تيمار شده به روشHPLC سنجيده شد. همچنين اين قارچ از محيط محرك توكسين جدا و mRNA آن استخراج شد. سپس با استفاده از آغازگرهاي عمومي cDNA آن سنتز و تغيير در بيان ژن aflR به‏طور كمّي و با استفاده از PCR در زمان واقعي بررسي شد. در نهايت تجزيه و تحليل آماري توسط SPSS نسخه 14 صورت گرفت. نتايج: با افزايش غلظت عصاره شيرين بيان ميزان توليد ميسليوم قارچ كاهش ‏يافت. بيشترين ميزان مهار كنندگي از رشد قارچ در غلظت 500 ميلي‏گرم بر ميلي‏ليتر مشاهده شد. تجزيه و تحليل نتايج HPLC نشان داد كه موثرترين غلظت عصاره شيرين بيان، غلظت 10 ميلي‏گرم بر ميلي‏ليتر بود كه باعث مهار توليد توكسين به ميزان 99/99 درصد شد. سنجش كمّي بيان ژن aflR تحت تاثير عصاره شيرين بيان نشان داد كه بيان اين ژن تا ميزان 40 درصد مهار شده است. نتيجه‏گيري: به‏طور كلي عصاره شيرين بيان مي‌تواند به‏طور چشمگيري تاثيرات مهاركنندگي بر بيان ژن aflR و توليد آفلاتوكسين در قارچ آسپرژيلوس پارازيتيكوس داشته باشد.

Objective: Aflatoxin is important in the food industry, in animal husbandry and the medical area; there are enormous negative economic impacts due to this toxin. Numerous studies have researched extracts and plant compounds with the intent to reduce the growth of aflatoxin-producing organisms, inhibit toxin production and suppress the major toxin encoded genes (i.e., aflR) in these organisms. Licorice is an important plant in traditional medicine that possesses numerous antimicrobial activities. There is no report regarding the effects of licorice or its mechanism of action on the aflatoxin-producing Aspergillus species. The present study focuses on the inhibitory effects of licorice extract on aflR gene expression and the growth and survival of Aspergillus parasiticus (A. parasiticus). Methods: After the culture of A. parasiticus in toxin-inducer medium, we measured the minimal inhibitory concentration (MIC) for licorice extract. The aflatoxin concentration in the control and treated media was determined by HPLC. After harvesting the fungi from the toxin-inducing medium, its mRNA was extracted and cDNA synthesized by universal primers. The quantitative change in the aflR expression was analyzed via real-time PCR. Statistical analysis was performed by SPSS (v16). Results: The production of fungal mycelium decreased with increasing concentrations of licorice extract. The highest inhibitory concentration observed was 500 mg/ml of the extract. HPLC analyses revealed that the 10 mg/ml concentration of licorice extract inhibited toxin production by 99.9%. At this concentration, aflR gene expression was suppressed up to 40% as documented by quantitative RT-PCR analysis. Conclusion: Overall we concluded that the Licorice extract could inhibit the aflR gene expression and consequently the aflatoxin production efficiently in the A. parasiticus.