مقايسه بيان شكل تغيير يافته BMP-7 در ميزبان‏هاي پروكاريوتي و يوكاريوتي

A Comparison of Bone Morphogenetic Protein-7 Mutant Expression in Prokaryotic and Eukaryotic Hosts

هدف: BMP-7 عامل رشد چند منظوره‏اي است كه اغلب به دليل خواص استخوان‏زايي خود شناخته شده است. به دليل قيمت بالا، دسترسي به اين پروتيين براي مصارف درماني محدود است. تاكنون توليد هترولوگ پروتيين نوتركيب BMP-7 در تعدادي از سيستم‏هاي بياني انجام يافته است. در مطالعه حاضر شكل جديدي از پروتيين در ميزبان‏هاي پروكاريوتي و يوكاريوتي بيان شده است. مواد و روش‏ها: براي بيان در سيستم بياني پروكاريوتي، پروتيين جديد به فضاي پري‏پلاسمي باكتري اشريشيا كلي ترشح شد و تخليص توسط ستون تمايلي انجام گرفت. براي بيان در سيستم بياني يوكاريوتي، قطعه cDNA با طول كامل به سلول يوكاريوتي CHO منتقل شد و كلون‏هاي پايدار انتخاب شد. بيان پروتيين نوتركيب در هر دو سيستم بياني توسط آزمون وسترن بلات تاييد شد. نتايج: پروتيين نوتركيب جديد به صورت دايمر با وزن مولكولي 36-38 كيلودالتون در سلول يوكاريوتي و به صورت مونومر با وزن مولكولي 16 كيلودالتون در سيستم بياني اشريشيا كلي توليد شد. تجزيه و تحليل كمّي با استفاده از الايزا نشان داد كه سطح بيان جهش يافته در سيستم بياني يوكاريوتي و پروكاريوتي به ترتيب 40 و 135 نانوگرم در هر ميلي‏ليتر از محيط كشت است. نتيجه‏گيري: در اين مطالعه سطح بيان پروتيين در اشريشيا كلي حداقل 3 برابر ميزان بيان در سلول يوكاريوتي بود. با اين وجود بهينه‏سازي‏هاي بيشتر براي به‏دست آوردن مولكول دايمر در اشريشيا كلي مورد نياز است. نتايج مطالعه مذكور نشان داد كه بيان پري‏پلاسمي ممكن است براي توليد پروتيين‏هاي پيچيده مانند BMPs مناسب باشد.

Objective: Bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) is a multifunctional growth factor predominantly recognized for its osteoinductive properties. Due to the high cost of this protein, the availability of BMP-7 for treatment is limited. The heterologous production of recombinant hBMP-7 has been performed in a number of expression systems. In this study a novel form of BMP-7 was expressed in eukaryotic and prokaryotic hosts. Methods: For expression in the prokaryotic system, the novel protein was secreted to the periplasmic space of Escherichia coli using a pelB signal sequence followed by single-step purification by Ni2+-charged column chromatography. In the mammalian cell expression system, we transferred a full-length cDNA encoding precursor of the novel protein to CHO cells then selected stable clones by using the appropriate antibiotic concentration. Expressions in both systems were confirmed by Western blot analysis. Results: The novel recombinant protein was produced as a 36-38 kDa dimer in the CHO cell line and a 16 kDa monomer in the Escherichia coli system. Quantitative analysis according to ELISA showed that the expression levels of the mutant protein in the eukaryotic and prokaryotic expression systems were 40 ng/ml and 135 ng/ml of the culture media, respectively. Conclusion: In this study, the expression level in Escherichia coli was at least three times more than observed in the CHO cells. However, further optimization is required to obtain a dimer protein in Escherichia coli. The results show that periplasmic expression may be suitable for the production of complex proteins such as BMPs.