افزايش فعاليت خود تجديد شوندگي سلول‏هاي بنيادي خون‏ساز بند ناف CD34+ با استفاده از سركوب بيان ژن گيرنده نوع دو TGF-b

TGF-bReceptor2 knocked down by SiRNA increases cord blood CD34+ HSCs self-renewal

هدف: امروزه سلول‏هاي بنيادي خون‏ساز بند ناف به يكي از مهم‏ترين منابع سلول‏هاي بنيادي خون‏ساز تبديل شده‏اند، اما متاسفانه تعداد محدود آن‏ها در واحدهاي خون بند ناف استفاده از آن‏ها را در موارد پيوند مغز استخوان بزرگسالان محدود نموده است. يكي از روش‏هاي در نظر گرفته شده براي غلبه بر اين مشكل، ازدياد سلول‏هاي بنيادي خون‏ساز با استفاده از افزايش فعاليت خود تجديد شوندگي آن‏ها در محيط كشت است. چنين به‏نظر مي‏رسد كه مسير TGF-b يكي از عوامل مهم مهاري فعاليت خود تجديد شوندگي سلول‏هاي بنيادي خون‏ساز است. در اين مطالعه سعي شده است تا با مهار علامت‏دهي مسير TGF-b ميزان تكثير خود تجديد شوندگي سلول‏هاي بنيادي و در نتيجه ازدياد آن‏ها را ارتقا يابد. مواد و روش‏ها: سلول‏هاي بنيادي خون‏ساز بند ناف CD34+ با استفاده از ستون‏هاي MACS از واحدهاي خون بند ناف جدا شدند. سلول‏هاي جداسازي شده به‏وسيله SiRNA بر عليه TGFbR2 ترانسفكت شده و طي كشت ميزان سركوب بيان ژن گيرنده نوع دو TGF-b (TGFbR2) با استفاده از Real-Time PCR كمّي بررسي شد و پس از اتمام دوره كشت از نظر نشانگر سطحي CD34 با استفاده از فلوسايتومتري و از نظر عملكردي با استفاده از LT-CIC و آزمون كلوني‏زايي ارزيابي شدند. نتايج: براساس نتايج بررسي حاضر مهار بيان ژن TGFbR2 موجب افزايش جمعيت سلول‏هاي خون‏ساز CD34+ مي‏شود. از سوي ديگر ارزيابي‏هاي LT-CIC و آزمون كلوني‏زايي افزايش تعداد سلول‏هاي بنيادي خون‏ساز اوليه را تاييد مي‏نمايد. نتيجه‏گيري: به‏نظر مي‏رسد به همان اندازه‏اي كه حضور عوامل محرك فعاليت خود تجديد شوندگي در موفقيت ازدياد سلول‏هاي بنيادي خون‏ساز بند ناف اهميت دارد، مهار عوامل مهاري هم داراي اهميت است و مهار علامت‏دهي مسير TGF-b به‏عنوان يكي از عوامل مهاري كليدي مي‏تواند به موفقيت ازدياد سلول‏هاي بنيادي خون‏ساز بند ناف در محيط آزمايشگاه كمك شاياني نمايد.

Objective: Nowadays, cord blood Hematopoietic stem cells (HSCs) are known as a valuable source for bone marrow transplantation but unfortunately their insufficient number is a limiting factor for using them in adult bone marrow transplantation. Cord blood HCSs expansion is an approach to overcome this problem, by inducing their self-renewal. TGF-b signaling pathway is a key inhibitory agent for HSCs self-renewal. In this study, we tried to enhance self-renewal of long term culture initiating cell by inhibiting TGFbR2 expression. Materials and Methods: CD34+ HSCs were isolated from cord blood units with MACS column. SiRNA against TGFbR2 was transfected by Lipofectamine™ RNAiMAX as transfection reagent. HSCs were cultured in IMDM medium containing 10% FBS and early acting cytokines (Flt3L, SCF, Tpo) for 8 days. Then we evaluated TGFbR2 expression by QRT-PCR. The CD34+ subpopulation of cultured cells were examined by flow cytometry on the 8th day. Finally the expanded cells were evaluated for the presence of early hematopoietic stem cells by LT-CIC and clonogenic assays. Results: According to our results, TGFbR2 down regulation increases CD34+ subpopulation of HSCs. In addition, LT-CIC assay showed an enhancement in primitive hematopoietic stem cell capable of self-renewal. Conclusion: All in all, it seems that positive regulators have attracted more attention in the field of HSCs expansion while negative regulators have same importance in self-renewal process of HSCs and their inhibition can be a beneficial tool for enhancement of HSCs self-renewa.