بررسي نقش اپي‏ژنتيكي ژن‏هاي RUNX2 و DLX5 در تمايز استيوبلاستيك سلول‏هاي بنيادي مزانشيمي ناشي از داروي زولدرونيك اسيد

Epigenetic changes of RUNX2 and DLX5 genes in osteoblastic differentiation induced by zoledronic acid in mesenchymal stem cells

هدف: زولدرونيك اسيد به‏عنوان يكي از درمان‏هاي بيماري استيوپورز در تمايز سلول‏هاي بنيادي مزانشيمي نقش دارد. با اين حال مكانيسم اثر اين دارو در القاي تمايز استيوبلاستيك سلول‏هاي بنيادي مزانشيمي هنوز به‏خوبي شناخته نشده است. بر اين اساس در اين تحقيق تاثير زولدرونيك اسيد روي متيلاسيون پروموتر ژن‏هاي RUNX2 و DLX5 ارزيابي شد. مواد و روش‏ها: سلول‏هاي بنيادي مزانشيمي انساني پس از جداسازي و تكثير، تحت تيمار ضرباني با زولدرونيك اسيد با غلظت نهايي 5 ميكرومولار به‏مدت 3 ساعت قرار گرفتند و به‏مدت 3 هفته در محيط تمايزي كشت داده شدند. استخراج DNA در هفته‏هاي اول، دوم و سوم تمايز استيوبلاستيك و همچنين از سلول‏هاي بنيادي مزانيشيمي صورت گرفت. پس از تيمار DNA با سديم بي‏سولفيت، آزمايش PCR اختصاصي متيلاسيون با استفاده از آغازگرهاي متيله و غير‏متيله به‏منظور ارزيابي متيلاسيون پروموتر ژن‏هاي RUNX2 و DLX5 انجام شد. نتايج: نتايج آزمايش PCR اختصاصي متيلاسيون با آغازگرهاي متيله و غيرمتيله براي ژن‏هاي RUNX2 و DLX5 در سلول‏هاي تمايز يافته استيوبلاستي و سلول‏هاي بنيادي مزانشيمي مثبت بود. بر اين اساس وضعيت متيلاسيون ناحيه پروموتري ژن‏هاي RUNX2 و DLX5 نشان دهنده متيلاسيون ناكامل است. نتيجه‏گيري: ژن‏هاي RUNX2 و DLX5 در تمايز استيوبلاستيك ناشي از داروي زولدرونيك اسيد تغيير آرايش متيلاسيون نمي‏دهند. نتايج بررسي حاضر نشان داد كه زولدرونيك اسيد به‏واسطه مكانيسم‏هاي اپي‏ژنتيكي به‏ويژه متيلاسيون پروموتر منجر به تمايز استيوبلاستيك سلول‏هاي بنيادي مزانيشيمي نمي‏شود. بر اين اساس، مكانيسم اثر داروي زولدرونيك اسيد در سلول‏هاي بنيادي مزانشيمي در القاي تمايز مي‏تواند يك مسير مستقل از تغييرات اپي‏ژنتيكي در اين دو ژن باشد.

Objective: Zoledronic acid as a main treatment for osteoporosis has an important role in differentiation of mesenchymal stem cells. However, mechanism of osteoblastic differentiation induction by zoledronic acid is not well understood until now. In this research we evaluate zoledronic acid effect on methylation status of RUNX2 and DLX5 promoters. Materials and Methods: After isolation and expansion of hMSCs from BM, they were pulse treated with 5?M ZA for 3h, and incubated in osteogenic differentiation medium for 3 weeks. DNA was extracted after first, second and third weeks of culture and also from undifferentiated MSCs. After SBS treatment, gene specific methylation analysis for RUNX2 and DLX5 were carried out by MSP using methylated and unmethylated primers. Results: In the genes RUNX2 and DLX5, M and U primers of MSP amplified promoter regions of undifferentiated and osteoblastic differentiated MSCs. Therefore, methylation status in RUNX2 and DLX5 promoters present incomplete methylation. Conclusion: Methyltion patterns of RUNX2 and DLX5 don’t change during zoledronic acid osteoblastic differentiation of MSCs. Our findings show that zoledronic acid does not induce osteoblastic differentiation via epigenetic mechanisms. Therefore, zoledronic acid can induce osteoblastic differentiation in a manner independent from DNA epigenetic changes.