كلونينگ و بيان ترشحي ژن ليپاز (BTL2) باسيلوس ترموكاتنولاتوس در پيكيا پاستوريس با استفاده از تواليهاي نشانه طبيعي و آلفا فاكتور مخمري

Cloning and secretive expression of Bacillus thermocatenulatus BTL2 lipase in Pichia pastoris Using natural and yeast α factor signal sequences

ليپاز (Triacylglycerol acylhydrolase EC 3.1.1.3 )، هيدروليز تري آسيل گليسرول به گليسرول و اسيدهاي چرب را در حد فاصل لايه چربي و آب كاتاليز مي كند. ليپازها در فرمولاسيون شوينده ها، تهيه بيوسورفكتانتها، صنايع روغن، غذايي، كشاورزي، چوب و كاغذ، پزشكي و دارويي كاربرد دارند. مهم ترين كاربرد اين آنزيم در صنايع شوينده است. در اين تحقيق، پس از استخراج DNA ژنومي باكتري باسيلوس ترموكاتنولاتوس ) Bacillus thermocatenulatus ( مولد ليپاز، ژن ليپاز btl2 (همراه با توالي نشانه و بدون توالي نشانه) با روش PCR تكثير و در حامل بياني pPIC9 تحت كنترل پروموتر الكل اكسيداز كلون شد pYV128) و (pYV129 پس از تاييد صحت كلونينگ توسط PCR و برش آنزيمي، پلاسميدهاي نوتركيب فوق با آنزيم Bgl II خطي شده و با روش الكتروپوريشن به ميزبان پيكيا پاستوريس (Pichia pastories) انتقال داده شدند. مخمر پيكيا پاستوريس نوتركيب در محيط BMGY كشت داده شد و با متانول بيان آنزيم ليپاز القا شد. وجود آنزيم در محيط كشت با آزمون پارانيتروفنيل پالميتات (pNPP) و روش ايمونوبلات تاييد شد. خالص سازي ليپاز نوتركيب به روش تعويض يوني انجام و فعاليت ويژه آنزيم به روش pH- stat تعيين شد. نتايج توليد U/L 18000 ليپاز نوتركيب در كشت فلاسك و كسب U/L12000 آنزيم نوتركيب خالص (راندمان خالص سازي 66 درصد) با فعاليت ويژه /mg? 5728 را نشان داد.

Lipase (Triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) hydrolyzes triacylglycerol to glycerol and fatty acids in the water and fatty acid interface. They have many applications in various industries including food, dairy, pharmaceutical, agrochemical, oleochemical and mainly in detergents. In this study btl2 gene (with and without signal sequence) was amplified from purified genomic DNA of Bacillus thermocatenulatus using primers designed based on the sequence in the GeneBank data base (GenBank X95309). PCR products were cloned in pGEM5zf vector. Then the genes were subcloned into the pPIC9 expression vector under alcohol oxidase (AOX1) promoter (pYV128, pYV129). Molecular and restriction enzyme analysis confirmed cloning accuracy. The recombinant plasmids were linearized with BglII enzyme and transferred into Pichia pastoris host cells with electroporation. Finally, recombinant yeasts were cultured in BMGY medium and induced with methanol. Para nitrophenyl palmitate (pNPP) test and Immunoblotting method showed presence of the recombinant lipases in medium culture. The recombinant lipase was purified by ion exchange chromatography method and the specific activity was measured. The results showed that the recombinant lipase production was 18000U/L in flask culture, which 12000U/L purified recombinant lipase with 5728U/mg specific activity was recovered with this purification method.