كلون، امتزاج و بيان نوتركيب ناحيه 4 آنتي ژن حفاظت كننده باسيلوس آنتراسيس با زيرواحد B كلرا توكسين در باكتري اشرشياكلي

Cloning, fusion and expression of recombinant Bacillus anthracis protective antigen domain 4 with cholera toxin B-subunit in E. coli

زمينه و هدف: تركيب يا اتصال ژنتيكي آنتي ژن ها با زير واحد B كلرا توكسين =cholera toxin B) (ctB پاسخ آنتي بادي موكوسي قوي اي را ايجاد مي كند. هدف از اين مطالعه اتصال ctB به ژن كد كننده ناحيه 4 آنتي ژن حفاظت كننده (Protective antigen Domain 4=PaD4) به منظور بيان پروتيين كايمريك به عنوان كانديدا واكسن عليه بيماري سياه زخم مي باشد. روش بررسي: در اين تحقيق تجربي آزمايشگاهي واكنش PCR با پرايمرهاي اختصاصي براي ژن هاي ctBو PaD4 انجام شد و ژن هاي تكثير شده به طور جداگانه در PGEM-T easy vector كلون شدند. سپس ژن PaD4 به انتهاي ʹ3 ژن ctB با روش هضم آنزيمي متصل شد و ژن امتزاج شده ctB-PaD4 در PET28a زير همسانه سازي گرديد. سويه BL21 باكتري E.coli توسط وكتور نوتركيب ترانسفورم شد و بيان پروتيين كايمر تحت القاي ايزوپروپيل- بتا-D-1-گالاكتوپيرانوزيد IPTG)) قرار گرفت و به وسيله تكنيك SDS.PAGE و وسترن بلات مورد ارزيابي قرار گرفت. يافته ها: ژن امتزاج شده ctB-PaD4 ساخته شد و با تكنيكPCR و تعيين توالي مورد تاييد قرار گرفت. اين ژن در باكتري E.coli سويه BL21در دماي بهينه 37 درجه سانتيگراد بيان گرديد و پروتيين كايمر با موفقيت توليد شد. باند مربوط به اين پروتيين با تكنيك SDS.PAGE و وسترن بلات تاييد گرديد. نتيجه گيري: اين پروتيين نوتركيب بعد از بررسي ايمني زايي مي تواند به عنوان واكسن زير واحدي كايمر جديد و موثر عليه باكتري باسيلوس آنتراسيس به صورت خوراكي يا استنشاقي استفاده شود.

Background and aims: The combination or genetic connection of the antigens with cholera toxin B (ctB) subunit creates a strong mucosal antibody response. The aim of this study was to connect ctB to protein in domain 4 encoding gene of Protein arginine Domainases (PaD4) to express chimeric protein as a candidate vaccine against anthrax. Methods: In this experimental study, polymerase chain reaction (PCR) using specific primers for genes ctB and PaD4 was performed and amplified genes were cloned separately in PGEM-T easy vector. Then, PaD4 gene was connected to the 3ʹ end of ctB by the enzymatic digestion method and then, ctB-PaD4 fusion genes were sub-cloned into the pET28a. The strain BL21 of E. coli bacteria was transformed by the recombinant vector. The expressed chimeric protein was induced by Isopropyl B-D-1-thiogalactopyranoside and evaluated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western blot techniques. Results: CtB-PaD4 fusion gene was constructed, confirmed by PCR techniques, and sequencing. This gene was expressed in the E. coli bacteria of strain BL21 at optimum temperature of 37°C, and the chimeric protein was produced successfully. The bond in this protein was confirmed by Western blot technique and SDS.PAGE. Conclusion: After immunogenicity assay, this recombinant protein can be used as a new and effective chimeric subunit vaccine against Bacillus anthraces for oral or nasal consumption in future studies.