جداسازي، همسانه سازي و امتزاج ناحيه N- ترمينال ژن ipaD شيگلا ديسانتريه و زيرواحد B سم ريسين

Isolation, Cloning and Fusion of N-Terminal Region of ipaD Shigella dysenteriea and Ricin Toxin B Subunit

شيگلا ديسانتريه پاتوژن مهمي است كه باعث ايجاد عفونت در روده انسان مي شود. آنتي ژنIpaD نقش مهمي در بيماري زايي و ايجاد عفونت توسط شيگلا دارد. چالش استفاده از پروتيين IpaD در طراحي واكسن مخاطي، قدرت پايين و عدم انتقال آن به بافتهاي مخاطي روده مي باشد. با اتصال ناقل و ادجوانت گياهي RTB به آنتي ژن IpaD، مي توان به رفع چالش توليد واكسن مخاطي عليه شيگلوزيس پرداخت. اين تحقيق با هدف ساخت يك كاست ژني شامل ناحيهN- ترمينال ژنipaD، كه به ژنRTB متصل شده است به عنوان رويكردي جديد براي توليد واكسن مخاطي عليه شيگلا صورت مي گيرد. DNA ژنومي گياه كرچك به روش CTABاستخراج شد. با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي، قطعه 819 نوكليوتيدي ژن RTB داراي لينكرGPGP، تكثير گرديد. واكنش PCRبراي تكثير ژن ipaD نيز انجام گرفت. هر يك از قطعات تكثير شده به درون وكتور pGEM-T همسانه سازي شدند. به منظور ساخت كاست ژني، ipaD با آنزيم‌هاي XhoI/HindIII از درون وكتور pGEM-ipaD خارج گرديد. متعاقب آن، پلاسميد نوتركيب pGEM-RTB تحت برش آنزيمي XhoI/HindIII قرار گرفت. طي فرايند الحاق ipaDبه پلاسميد نوتركيب pGEM-RTB براي ساخت كاست ژني RTB-ipaD همسانه سازي شد؛ و با استفاده از دستگاه توالي ياب، توالي نوكليوتيدي كاست ژني شناسايي گرديد. پس از تاييد كلونينگ ژنهاي RTB و ناحيه N-ترمينال ژن ipaD، كاست ژني ساخته شده با عمل PCR،Nested-PCR ، برش آنزيمي و تعيين توالي مورد تاييد قرار گرفت. بر اساس آخرين اطلاعات، اين اولين گزارش از طراحي و ساخت كاست ژني RTB-ipaD مي باشد، كه مي تواند براي توسعه توليد واكسن مخاطي عليه شيگلوزيس به كار رود. اين تحقيق مسيري راهبردي را براي توليد فيوژن پروتيين و مطالعات ايمنولوژيكي مي گشايد.

Shigella dysenteriae is an important pathogen that induces acute enteric infection in humans. IpaD antigen plays an important role in the creation and induction of infection by Shigella. The challenges of using ipad in designing mucosal vaccines against Shigella are the limited potency and lack of transfer to mucosal tissues. By linking IpaD antigen to Ricin toxin B subunit as carrier and adjuvant, we can overcome the challenges of producing mucosal vaccines. This study aimed to construct a gene cassette containing the N-terminal region of ipaD gene connected to the RTB gene as a new approach for generating mucosal vaccines against Shigella. Genomic DNA of Ricins communis was extracted by the CTAB method. Using specific primers, a fragment containing 819 nucleotides of the RTB gene with linker was amplified. PCR was performed to amplify the ipaD gene. Each amplified fragment was cloned into the pGEM-T vector. In order to construct a gene cassette, ipaD was ejected from the vector pGEM-ipaD with enzymes XhoI / HindIII. Subsequently, the recombinant plasmid pGEM-RTB was cut with XhoI / HindIII enzymes. During the process of ligation, ipaD was inserted into the pGEM-RTB recombinant plasmid to construct RTB-ipaD gene cassette, and then the gene cassette was sequenced by the sequencer. After confirming the cloning of N-terminal region of ipaD and RTB genes, accurate construction of the gene cassette was confirmed by PCR, Nested-PCR, restriction enzyme and sequencing. Base on the latest information, this is the first report of designing and construction of RTB-ipaD gene cassette, which can be used for generating a suitable candidate mucosal vaccine agaist shigellosis. This study also creates a strategic direction for the production of fusion proteins and immunological studies.