توليد و تغليظ ناقل ويروسي بر پايه MLV و مقايسه ترانسداكسيون رده هاي سلولي سرطاني و غير سرطاني با ناقل توليد شده

Production and Concentration of an MLV Based Viral Vector and Comparison of Cancerous and non-Cancerous Cell Lines Transduction with Produced Vector

ابزارهاي گوناگوني به منظور انتقال ژن به سلول هاي يوكاريوتي توسعه يافته اند. در ميان آن ها، كارايي ويروس هاي RNA دار متعلق به خانواده رتروويريده در انتقال ژن به دليل الحاق پايدار ژنوم خود در كروموزوم هاي ميزبان بالاتر است. ويروس لوكمي موش (MLV) شناخته-شده ترين عضو جنس اورتورتروويرينا از گامارتروويروس ها است. ناقل رتروويروسي بر پايه MLV تنها قادر به بيان ژن هاي خارجي در سلول-هاي در حال تقسيم ميتوز مي باشد، كه بيانگر مناسب بودن اين ناقل به عنوان ابزار انتقال ژن در ژن درماني سرطان است. دراين تحقيق، ناقل ويروسي بر پايه MLV از طريق ترانسفكشن همزمان و گذرا سه پلاسميد رتروويروسي شامل pBABE-GFP (پلاسميد بياني داراي ژن گزارشگر GFP)،pBS-CMV-gagpol (پلاسميد بسته بندي داراي ژن gagpol ويروس MLV) وpMD2G (پلاسميد پوششي حاوي ژن VSVG) در رده سلولي HEK293T توليد شد. تغليظ ويروس با دو روش اولتراسانتريفيوژ و محلول پلي اتيلن گليكول انجام شد. رقت هاي سريالي از ويروس غليظ شده تهيه گرديد و عيار ويروس بر حسب واحد عفوني بر ميلي ليتر (106 × 21 ذره عفوني در هر ميلي ليتر در هر دو روش) محاسبه شد. سپس كارايي ترانسداكسيون رده هاي سلولي سرطاني (A549 و Hela) و غير سرطاني (HEK و Vero) با ناقل ويروسي توليد شده مقايسه گرديد. نتايج بدست آمده نشان داد كه كارايي ناقل در آلوده كردن سلول هاي سرطاني بالاتر است و بنابراين ناقل توليد شده در زمينه انتقال ژن به سلول هاي سرطاني مناسب تر مي باشد.

Various tools have been developed to deliver genes into eukaryotic cells; among them, the efficiency of RNA-containing viruses belonging to the family of Retroviridae is higher than other viruses because integrate their genomes into the target cell chromosomes. The Murine Leukemia Virus (MLV) is the most prominent member of orthoretrovirinae genus of gammaretroviruses. An MLV-based retroviral vector can only express transgenes in cells undergoing mitosis, indicating its suitability as a delivery vehicle for cancer gene therapy. In this study, an MLV-based viral vector was produced in the HEK293T cell line by transient cotransfection of three plasmids including pBABE-GFP (plasmid expressing GFP reporter gene), pBS–CMV–gagpol (plasmid consisting of Gag-Pol genes) and pMD2.G (plasmid expressing VSVG gene). The produced viral vector was concentrated by ultracentrifuge and poly ethylene glycol methods. Serial dilutions were prepared from concentrated virus and virus titer was calculated according to infectious unit per milliliter (21×106 infectious particles per milliliter in both methods). Then, the transduction efficiency of cancerous cell lines (A549 and Hela) and non- cancerous cell lines (HEK and Vero) was compared by the produced viral vector. The results showed that efficiency of the generated vector to infect cancer cells in comparison with other cells was higher and thus was more suitable for gene transfer into cancer cell lines.