معرفي روشي مناسب جهت جداسازي اووسيست‌هاي كريپتوسپوريديوم پارووم فاقد باكتري از مدفوع حيوانات آلوده

Presenting an Appropriate Method for Isolation of Bacteria Free Cryptosporidium parvum Oocysts

كريپتوسپوريديوم پارووم تك ياخته‌اي مشترك بين انسان و حيوان مي‌باشد، كه در افراد دچار نقص ايمني و نوزاد حيوانات بخصوص گوساله‌ها بيماريزا مي‌باشد. اووسيست‌هاي دفع شده از دام‌هاي آلوده باعث آلودگي محيط بخصوص منابع آب‌هاي سطحي مي‌شوند. با توجه به اين كه حتي تعداد كم اووسيست مي‌تواند آغازگر بيماري باشد و از طرف ديگر اووسيست‌ها به ضدعفوني كننده‌هاي متداول مقاومند، اين تك ياخته مورد توجه محققين قرار گرفته و همواره تلاش شده است روش‌هاي جداسازي و تخليص اووسيست‌هاي كريپتوسپوريديوم حتي در نمونه‌هاي محيطي داراي تعداد كم اووسيست بهينه شود و اووسيست‌هايي كاملا خالص و عاري از آلودگي‌هاي باكتريايي و ساير ناخالصي‌ها به منظور مطالعات ايمنولوژيكي و مولكولي فراهم گردد. روش‌هاي مختلفي كه تا كنون استفاده شده‌اند تا حدودي موفقيت آميز بوده‌اند ولي هيچيك نتوانسته‌اند به اووسيست عاري از باكتري دست پيدا كنند. هدف از اين تحقيق دست يابي به اووسيست عاري از باكتري مي‌باشد. در اين تحقيق به منظور جداسازي اوليه اووسيست‌هاي كريپتوسپوريديوم، ابتدا چهار روش شناورسازي شامل استفاده از محلول نمك طعام، محلول ساكارز، شيب غلظتي پلكاني فايكول و محلول ساكارز 55 درصد استفاده گرديد. محلول ساكارز 55 درصد بهترين روش براي جداسازي اوليه اووسيست‌هاي كريپتوسپوريديوم ارزيابي گرديد. جهت حذف باكتري و ساير ناخالصي‌هاي همراه از فيلتر نيتروسلولز (با منافذ 3 ميكرون) استفاده گرديد. آناليز اووسيست‌هاي استخراج شده نشان داد كه اووسيست‌هاي حاصل از فيلتراسيون عاري از هرگونه باكتري بود و درصد آن‌ها 30 ارزيابي گرديد. اگر چه تعداد زيادي از اووسيست‌ها در حين تخليص از دست رفتند، اما اووسيست‌هاي تخليص شده براي آزمايشات پروتيوميكس بسيار مناسب مي‌باشند.

Cryptosporidium parvum is a zoonotic protozoan which causes disease in immunocompromised patients and newborn animals especially calves. The oocysts excreted by infected animals are introduced into the environment and water. Since the low number of oocyst can cause infection and there is no effective disinfectant against cryptosporidium, the investigation dealing with the cryptosporidiosis is of growing interest among many researchers. Therefore, they try to improve the existing isolation methods of C. parvum oocysts even in environmental samples with small number of oocysts, to obtain much purified oocysts for immunological and molecular studies. Different methods have gained some success on the isolation of cryptosporidium, but they didn’t result in obtaining completely pure oocysts. The aim of the present study was to try to develop an isolating system for bacteria free oocysts. For this aim, four flotation methods have been used to isolate the C. parvum oocysts from the feces, including NaCl floatation, sucrose floatation, ficoll gradient and 55% sucrose floatation. A floatation method based on 55% sucrose was evaluated as the best method for the primary isolation of Cryptosporidium oocytes. The nitrocellulose filter (with 3µm pore size) was used to remove bacteria and other contaminants. Our results suggest that the oocysts isolated using filtration were free of bacteria and the amount of pure oocysts was 30%. Although the amount of isolated oocysts was limited, the isolated pure oocysts can be used for proteomics studies.