شناسايي چند شكلي هاي موجود در ژن GDF9 و ارتباط آن با دو قلوزايي در گوسفند بلوچي با استفاده از روش RFLP-PCR

Detection of polymorphism in GDF9 gene and its association with twining in Baluchi sheep using RFLP-PCR

اين تحقيق به منظور شناسايي جهش هاي موجود در ژن GDF9 در گوسفند بلوچي و ارتباط آن با دو قلوزايي انجام گرفت. از تعداد 152 راس گوسفند بلوچي نمونه خون تهيه و استخراج DNA با استفاده از روش نمكي بهينه يافته صورت گرفت. كميت و كيفيت DNA استخراج شده با استفاده از روش طيف سنجي و الكتروفورز كنترل گرديد. با استفاده از پرايمر اختصاصي يك قطعه 462 جفت بازي از ناحيه اگزون يك ژن GDF9 توسط واكنش زنجيره اي پلي مراز (PCR) تكثير و سپس هضم آنزيمي محصولات PCR با استفاده از آنزيم برشي اختصاصي HhaI صورت گرفت. نتايج حاصل از هضم آنزيمي وجود جهش را در اين جايگاه ژني تاييد نمود. آلل وحشي اين ژن G(+) با دو جايگاه برش قطعاتي به طول هاي 52، 156 و 254 جفت باز و آلل جهش يافته G(-) با يك جايگاه برش قطعاتي به طولهاي 52 و410 جفت بازي ايجاد نمود. در ژنوتيپ هتروزيگوت چهار قطعه به طول هر يك 52، 156، 254 و 410 جفت باز حاصل شده است. فراواني آللي براي آلل هاي G(+) و (-)G به ترتيب 84 و16 درصد و فراواني هر يك از ژنوتيپ هاي G(+/+)، G(+/-) و G(-/-) در نمونه هاي تعيين ژنوتيپ شده به ترتيب 71، 26 و 3 درصد محاسبه شد. هتروزيگوسيتي مشاهده شده، هتروزيگوسيتي مورد انتظار و متوسط هتروزيگوسيتي به ترتيب 2697/0، 2688/0 و2688/0 برآورد گرديد. بررسي تعادل هاردي واينبرگ با استفاده از آزمون 2 c نشان داد كه جمعيت مورد مطالعه در جايگاه ژني مورد نظر در تعادل نمي باشد (005/0 > p). آناليز آماري داده هاي حاصل از اثر ژنوتيپ روي تعداد بره توليد شده در هر زايش معني دار، به طوري كه ميش هاي با ژنوتيپ هتروزيگوت نسبت به دو ژنوتيپ ديگر بالاترين ميانگين تعداد بره را در هر زايش نشان دادند (05/0 > p). به دليل پايين بودن توارث پذيري نرخ بره گيري در گوسفند، ظهور اين صفت تنها در جنس ماده و نيز عدم بروز آن در اوايل زندگي حيوان، دست يابي به ماركرهاي ژنتيكي مي تواند به عنوان يك ابزار مناسب و كارآمد در برنامه هاي انتخاب مورد استفاده قرار گيرد.

This study was carried out to evaluate the genetic polymorphism in GDF9 gene and its association with twining in Baluchi sheep. Blood samples were taken from 152 individuals and genomic DNA was extracted using modified salting out method. The quantitative and qualitative characteristics of extracted DNA was evaluated by spectrophotometric and gel electrophoresis method. Using a pairs of specific primers a DNA fragment with the size of 462 bp was amplified from exon 1 of GDF9 gene using polymerize chain reaction (PCR). The resulted PCR products were digested with HhaI restriction enzyme and the results showed a mutation at GDF9 locus in Baluchi sheep. The wild type allele (G+) with two restriction site resulted DNA fragments with the sizes 156, 52 and 254 bp while the mutant allele (G-) with one restriction site resulted two DNA fragments with the sizes of 52 and 410 bp. In heterozygous animals four DNA fragments with the sizes 52, 156, 254 and 410 bp were detected. The allelic frequency for G(+) and G(-) was estimated 0.84 and 0.16% and the frequency of genotypes G(+/+), G(+/-) and G(-/-) were calculated 71, 26 and 3%, respectively. The observed, expected and average heterozygosity were calculated 0.2697, 0.2688 and 0.2688, respectively. The ?2 test showed that the examined population is not in Hardy-Weinberg equilibrium at GDF9 locus (P < 0.005). The resulted of statistical data analysis for the effect of genotype on litter size was significant, since the ewes with heterozygote genotype had the highest mean litter size compared to the other two genotypes (P < 0.05). Thus, the litter size in sheep is low heritable, expressed only in females and did not manifest in early life, therefore, access to genetic markers can be used as an efficient and suitable tools in selection programs.