شناسايي سريع Clostridium perfringens تايپ‌هايA، B،C، D به روش Multiplex PCR

Fast detection of Clostridium perfringens Type A,B,C and D by Multiplex PCR

Clostridium perfringens بخشي از فلور طبيعي خاك مي‌باشد و گزارشات متعددي از جدا شدن اين ارگانيسم از مواد غذايي خام و پخته وجود دارد. اين باكتري به پنج تايپ A تا E تقسيم شده است و اين تقسيم بندي بر اساس توليد سم آلفا، بتا، اپسيلون و يوتا مي‌باشد. در اين مطالعه از واكنش multiplex PCR جهت شناسايي باكتري Cl. perfringens تايپ‌هاي A, B,C, D استفاده شد. تاييد اوليه تيپ‌هاي باكتريايي مورد استفاده با روش بيوشيميايي و سرولوژيكي صورت گرفت. جهت شناسايي بوسيله PCR، چهار جفت پرايمر با دماي ذوب نزديك به هم طراحي گرديد. قطعات تكثير يافته براي تيپ‌ A، 1167 جفت باز (سم آلفا) و براي تيپ‌ B، 1167 و 1025 و 961 جفت باز (سم آلفا، سم بتا و سم اپسيلون) و براي تيپ‌ C، 1167 و 1025 جفت باز (سم آلفا و سم بتا) و براي تيپ‌ D، 1167 و 961 جفت باز (سم آلفا و سم اپسيلون) بود. جهت بررسي ويژگي واكنش از باكتري Cl. botulinum به عنوان كنترل منفي استفاده شد كه نتايج PCR آن با پرايمرهاي طراحي شده منفي بود. نتايج اين تحقيق نشان داد كه شناسايي كلستريديوم پرفرنجنس با استفاده از multiplex PCR بسيار ساده، حساس، اختصاصي و در حداقل زمان بوده و مي‌توان جهت تعيين تايپ‌هاي A, B,C, D Cl. perfringens استفاده نمود.

Clostridium perfringens is a part of the microflora of soil, and many reports have revealed the widespread occurrence of this organism in raw and processed foods. C. perfringens is classified into five types (types A to E), depending upon their ability to express alpha, beta, epsilon, and iota toxins In this study, a multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay was developed for detection of C. perfringens types A, B, C and D. These strains have formerly been confirmed by the biochemical methods as well as serological test. For detection by PCR, four primer pairs with equal melting temperatures, were designed. DNA amplification fragments of 1167 bp for C. perfringens type A alone (? toxin), 1167 bp, 1025 bp and 961 bp for C. perfringens type B (?, B and ? toxin) 1167 bp and 1025 bp for C. perfringens type C (? and B toxin), and 1167 bp and 961 bp for C. perfringens type D (? and ? toxin) were obtained. Clostridium botulinum ued as negative control and did not yield a PCR product. These findings suggest that the assay is easy, timesaving, sensitive and specific and can use for detection of A, B, C and D types of C. perfringens.