پيشگيري از بيان ژن VEGFR-1 در محيط كشت، با استفاده از به‌كارگيري siRNA اختصاصي در درمان نيوواسكولاريزاسيون چشم

Preventing the expression of VEGFR-1 in culture medium using specific SiRNA - as a potential therapeutic method in eye neovascularization

زمينه و هدف: آنژيوژنز، از مهمترين فرايندهاي زيستي است كه هر گونه اختلال در آن، به بيماري منجر مي‌شود. نقطه اصلي در هدايت سيگنالينگ اين فرايند، فاكتور رشد اندوتليال عروقي است كه از طريق رسپتورهايش اعمال اثر مي‌كند. مطالعه حاضر، در جهت مهار بيان رسپتور تيپ ? اين فاكتور (VEGFR-1)، با استفاده از siRNA اختصاصي در محيط كشت، به منظور استفاده از تاثير مهاري آن در درمان نيوواسكولاريزاسيون چشم صورت گرفت. روش تحقيق: در اين مطالعه تجربي، ابتدا با استفاده از توالي ژن هدف، توالي‌هاي siRNA اختصاصي، عليه آن طراحي، Blast و ساخته شد. از طرف ديگر، cDNA سلولHUVEC، سنتز و ژن هدف، با كمك پرايمر اختصاصيVEGFR1 و PCR، به ميزان مورد نياز تكثير شد؛ سپس در وكتور بياني PEFGP-N1، كلون و تاييد شد. پلاسميد ناقل حاصل، با استفاده از ليپوفكتامين، به سلول Hela كه فاقد بيان ژن هدف بود، انتقال داده شد. ميزان بيان GFRدر وكتور اوليه و وكتور كلون‌شده، در حضور و عدم حضور siRNA اختصاصي عليهVEGFR1 مورد ارزيابي قرار گرفت و ميزان مهار ژن، از طريق ارزيابي كاهش فلورسانس سبز رنگ ناشي از GFP، وسترن بلات و RT-PCR مورد بررسي قرار گرفت. نتايج، با استفاده از آزمون تي‌تست، مورد آناليز قرار گرفت و 05/0P < معني‌دار در نظر گرفته شد. يافته‌ها: فلورسانت ناشي از اثر siRNA در گروه هدف در مقايسه با گروه كنترل كاهش داشت SDS Page و وسترن بلاتينگ از سلول حاوي وكتور مواجهه ‌يافته با هر دو نوع siRNA، كاهش ميزان پروتيين را نشان داد. نتايج حاصل از دو siRNA به كاررفته، بيانگر كاهش بيان ژن در سطح رونويسي و ترجمه در مقايسه با گروه كنترل بود (05/0P < ). نتيجه‌گيري: siRNA اختصاصي طراحي‌شده عليه VEGFR-1، با استفاده از ليپوفكتامين، به طور مناسب به داخل سلول منتقل و از بيان رسپتور، به طور معني‌دار جلوگيري نمود؛ لذا احتمالاً به عنوان يك فاكتور مناسب درماني جديد، در جلوگيري و يا كاهش نيوواسكولاريزاسيون در چشم، مطرح باشد.

Background and Aim: Angiogenesis is one of important biological processes any disruption in which leads to disease. The main signaling factor in this process is VEGF which acts through its receptors. The present study was done in order to inhibit the expression of receptor type1of this factor (VEGFR-1) using specific siRNA in the culture medium to use its inhibitory effect on neovascularization in the eye. Materials and Methods: In this experimental study; first, using target gene sequences, sequences of the specific siRNA were designed against them; blasted and manufactured. On the other hand, cDNA of HUVEC cell was synthesized and PCR, with specific primers for target gene, was reproduced as necessary. Then, PEFGP-N1 expression vectors were cloned and confirmed. Then, the obtained plasmid vector was transferred to Hela cells lacking target expressive genes through lipofectamin. GFR expression rate in the initial vector and in the cloned one, both in presence and in absence of specific VEGFR1 siRNA, was assessed. Evaluation of gene inhibition was carried out through decreasing of green fluorescence from GFR, Western blot and RT-PCR. Results were analyzed using T-test and P < 0.05 was taken as the significant level. Results: The fluorescence emission from defined siRNA decreased compared to control group. SDS pages and blots from vector cloned cells exposed to both siRNA showed reduced protein expression The outcome of applying two siRNA indicates gene expression in the form of transcription and translation, compared to the control group (P < 0.05). Conclusion: Specifically designed siRNA against VEGFR1, through lipofectamin, was appropriately transferred into cell and significantly prevented from the receptor expression. In fact, by blocking angiogenesis signaling route, it was able to prevent neovascurization. Thus, this can be made use of as an appropriate factor in preventing or decreasing neovascularization in the eye.