طراحي واكنش زنجيره‌اي پلي‌مراز بهبوديافته جهت تشخيص مولكولي باكتري استرپتوكوكوس نيومونيا

Design of an Improved Polymerase Chain Reaction (PCR) Assay for Molecular Detection of Streptococcus pneumonia

زمينه و هدف: باكتري استرپتوكوكوس نيومونيا عامل مننژيت باكتريايي و يك عامل مهم مرگ و مير در كودكان و افراد سالخورده است. كنترل اين بيماري نيز وابسته به تشخيص سريع باكتري مي‌باشد. روش‌هاي تشخيص اين باكتري شامل رنگ‌آميزي گرم، كشت و تست‌هاي سرولوژيكي است. اين روش‌ها وقت‌گير و در اثر مصرف آنتي‌بيوتيك منجر به نتايج منفي كاذب مي‌شوند. در حال حاضر، روش‌هاي مولكولي مانند PCR به‌صورت روزانه براي تشخيص عوامل عفوني استفاده مي‌شوند. اين مطالعه با هدف طراحي يك واكنش بهبوديافته PCR جهت تشخيص باكتري استرپتوكوكوس نيومونيا صورت گرفت. روش بررسي: پرايمرهاي تشخيصي اختصاصي براساس ژن ply باكتري طراحي گرديد. پس از تكثير ژن هدف در DNA ژنومي باكتري، محصول PCR در پلاسميد pTZ57R/T كلون شد و پلاسميد تاييدشده pTZ-ply به‌عنوان كنترل مثبت در آزمايشهاي بعدي مورد استفاده قرار گرفت. جهت تعيين حساسيت واكنش، رقت‌هاي متوالي 10 تايي از پلاسميد pTZ-ply تهيه و بر روي آنها واكنش PCR انجام گرفت. براي تعيين ويژگي واكنش از ژنوم تعدادي باكتري‌ مرتبط يا غيرمرتبط در واكنش PCRاستفاده شد. يافته‌ها: نتايج PCR مطابق انتظار، قطعه 727 جفت باز را نشان داد. هيچ‌گونه تكثيري در PCR بر روي ژنوم باكتري‌هاي كنترل منفي ديده نشد. اين نتايج نشان‌دهنده ويژگي بالاي واكنش PCR بود. پايين‌ترين حد تشخيص اين آزمون در تشخيص ژن ply، 250 كپي از ژن در يك واكنش 25 ميكروليتري بود. نتيجه‌گيري: حساسيت، ويژگي و سرعت بالاي آزمون طراحي‌شده، آن را به‌عنوان يك تست مناسب براي استفاده در آزمايشگاه‌هاي كلينيكي مطرح مي‌كند. همچنين ارزيابي بيشتر اين آزمون با استفاده از نمونه‌هاي كلينيكي يا مواد آلوده‌شده مصنوعي، كاربرد اين روش را در مجموعه‌‌اي كلينيكي تاييد خواهد كرد.

Background and Objectives: Streptococcus pneumoniae accounts for bacterial meningitis and is an important cause of morbidity among children and elderly. Control of this disease depends on rapid detection of the causative bacteria. The methods for detection of Streptococcus pneumoniae are gram staining, culture, and serological tests. These tests are time consuming and are limited by antimicrobial agents leading to false negative results. Currently, molecular methods such as PCR are used routinely for detection of infectious organisms. This study was performed with the aim of designing an improved PCR assay for the detection of Streptococcus pneumoniae. Methods: The specific diagnostic primers were designed based on ply gene of the bacterium. After amplifying the target gene on the genomic DNA, the PCR product was cloned in pTZ57R/T plasmid and the confirmed pTZ-ply plasmid was used as positive control in next experiments. Sensitivity of the assay was determined by performing the PCR on 10-fold serial dilutions of pTZ-ply. Specificity of the assay was determined using the genomic DNA of other related or unrelated bacterial species. Results: The PCR, as expected, generated a 727bp amplicon. No PCR amplification was observed on the genome of negative controls. These findings indicate high specificity of the PCR. The lowest limit of detection of the assay in the detection of the ply gene was 250 copies in a 25µl reaction. Conclusion: The high sensitivity, specificity, and rapidity of the designed assay suggested the assay as an appropriate test for use in clinical laboratories. The further evaluation of the assay using clinical samples or artificially contaminated materials will confirm the application of this assay in clinical settings.