بررسي روند تمايز سلول هاي شبه سلول عضله اسكلتي مشتق از سلول هاي بنيادي مزانشيمي بافت چربي انسان تحت تاثير 5-azacytidine در شرايط آزمايشگاه

Evaluation of the differentiation process of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells to skeletal muscle-like cells: An in vitro study

هدف و زمينه : در اين مطالعه روند تمايز سلول هاي شبه سلول عضله اسكلتي مشتق از سلول هاي بنيادي مزانشيمي بافت چربي انسان تحت تاثير 5-azacytidine در شرايط آزمايشگاه مورد بررسي قرار گرفت. مواد و روش ها: سلول هاي بنيادي بافت چربي انسان بعد از تخليص، براي ايجاد تمايز استيوژنيك و آديپوژنيك، تحت تاثير محيط هاي كشت القايي استيوژنيك و آديپوژنيك قرار گرفتند. از طرف ديگر، براي بررسي توان تمايز اين سلول ها به سلول عضله اسكلتي از فاكتور 5-azacytidine [5-aza] استفاده شد. به مدت 24 ساعت براي القاي تمايز به سلول عضله اسكلتي تحت تاثير 3µmol 5-azacytidine قرار گرفتند. سپس، اين محيط كشت القايي با PBS شسته شد و سلول ها تا 4 هفته با محيط كشت فاقد 5-azacytidine انكوبه شدند. براي بررسي روند تمايز سلول ها از مقايسه الگو و ميزان بيان mRNA ژن هاي اختصاصي عضله اسكلتي شامل Myogenin، Myh، a-actin، Tropomyosin و Myosin با روش RT-PCR در پايان هفته هاي اول تا چهارم بعد از القا استفاده شد. يافته ها: سلول هاي بنيادي مزانشيمي بافت چربي چسبنده، توان تكثيري قابل ملاحظه اي را نشان دادند و مانند مطالعات پيشين پتانسيل تمايز استيوژنيك و آديپوزنيك را نيز داشتند.mRNA ژن هاي مورد بررسي به صورت الگويي وابسته به زمان بيان شدند. به نحوي كه بيان mRNA ژن Myog در تمام نمونه هاي هفته 1 تا 4، به طور معني دار با روندي صعودي افزايش يافته بود. ژن Myh در هفته 2 نسبت به ساير هفته ها بيشترين ميزان بيان خود را داشته و در هفته 4 به كمترين مقدار خود رسيده بود. ميزان بيان ژن هاي a-actinin و Myosin در هفته 1 پايين بود. اما از هفته 2 الي 4 به طور معني دار با روندي صعودي افزايش يافته بودند. ژن Tropomyosin در هيچكدام از نمونه ها بيان معني داري نداشت. نتيجه گيري: مطالعه حاضر نشان داد كه سلول هاي بنيادي مزانشيمي بافت چربي انسان مي توانند تحت تاثير 5-azacytidine 3µmol به سلول عضله اسكلتي تمايز پيدا كنند و با افزايش مدت زمان القا، اين سلول هاي عضلاني اسكلتي تكوين يافته تر مي شوند.

Background Objectives: This study was carried out to evaluate the development of skeletal muscle-like cells derived from human adipose tissue mesenchymal stem cells induced by 5-azacytidine [5-aza] under in vitro condition. Materials and methods: Human adipose tissue mesenchymal stem cells [ADSCs] were purified. These cells were cultured in osteogenic or adipogenic induction medium to induce osteogenic and adipogenic differentiation. On the other hand, the skeletal myogenic differentiation potential of these cells was investigated using 3µmol 5-azacytidine [5-aza] treatment for 24 hours. Then the culture was washed out by PBS and were put in the culture medium free of 5-aza for another 4 weeks until sampling. RT-PCR assay was performed to detect the expression of specific skeletal muscle genes including Myogenin, Myh, alpha-actin, tropomyosin and myosin at 1-4 weeks after the first induction. Results: The adherent adipose tissue-derived mesenchymal stem cells exhibited a significant proliferative capacity and also showed osteogenic and adipogenic differentiation as seen in previous studies. The expression of four skeletal muscle cells genes was detected 1st to 4th week after induction in a time-dependent manner. There was a continuous increase in expression of Myogenin gene from the 1st to 4th week, whereas that of the Myh was higher after two weeks and lower after 4 weeks in comparison to the other weeks. The levels of mRNA of alpha-actin and Myosin expression were at the highest level in the fourth week. Expression of tropomyosin gene was not significant in the samples. Conclusion: The current study indicated that stimulating human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells by 5-aza with the concentration of 3µmol under in vitro condition can lead to differentiating skeletal muscle-like cells. Furthermore prolonged culture duration may lead to more differentiated cells.