كلونينگ و بيان ژن اينترفرون آلفا 2b ي انساني در سيستم بياني اشرشياكلي

Production of Human Alpha 2b Interferon in E.coli Expression System

زمينه و هدف: اينترفرونها وسيله دفاعي بدن عليه ويروسها هستند كه به سرعت در بدن توليد شده، سلولهاي اطراف را به توليد پروتيينهايي كه تكثير ويروس را مهار، يا پاسخ ايمني و رشد سلولي را كنترل ميكنند، تحريك 2 انساني در ايران و جهان، b ميكنند. با توجه به اهميت دارويي اينترفرون آلفا توليد اين دارو در داخل كشور و از طريق بيوشيميايي امكانپذير اما بسيار مشكل ميباشد. زيرا توليد اين پروتيين توسط سلولهاي سالم بسيار كم انجام ميشود. 2b و بيان ژن اينترفرون آلفا (Cloning) هدف از اين تحقيق، همسانه سازي انساني در باكتري اشرشياكلي در يك سيستم بياني مناسب جهت امكان هدايت پروتيين توليدشده به فضاي پريپلاسمي باكتري است. بيان در پريپلاسم، فضاي عالي براي تشكيل پيوندهاي صحيح و پيچش صحيح ايجاد ميكند. ناخالصي پروتيين و فعاليت پروتيازها در پريپلاسم كمتر از سيتوپلاسم است و تخريب و تجزيه پروتيينها در پريپلاسم كمتر اتفاق ميافتد. 2 پس از تكثير با آغازگرهاي اختصاصي در b روش بررسي: ژن اينترفرون آلفا و پپتيد نشانه پريپلاسمي T تحت كنترل پروموتور 7 pET-26b(+) ناقل بياني كلون گرديد و به XhoI و NcoI و با استفاده از آنزيمهاي برشي pelB منتقل گرديد. همسانهسازي ژن BL21(DE باكتري اشرشياكلي سويه ( 3 ،Colony PCR با استفاده از pET-26b(+) اينترفرون آلفا در ناقل بياني هضم آنزيمي و تعيين توالي، تاييد شد. سپس بيان ژن اينترفرون آلفا با استفاده از آناليز بلات نقطهاي در فضاي پريپلاسمي و به صورت پروتيين كل در زمانهاي مورد بررسي قرار گرفت. IPTG مختلف پس از القا با يافتهها: با استفاده از آناليز بلات نقطه اي تاييد شد كه پروتيين نوتركيب 2 در سيستم بياني اشرشياكلي توليد و وارد فضاي پريپلاسمي b اينترفرون آلفا باكتري شده است. 2b نتيجه گيري: اين تحقيق ميتواند امكان توليد پروتيين مهم اينترفرون آلفا انساني نوتركيب را در شكل صحيح خود و با صرف هزينه هاي بسيار پايينتر فراهم آورد.

Background and Objective: Interferons are part of the bodyʹs defense system against viruses. These proteins are generated in the body, and then they trigger the cells around them to produce inhibitor proteins against virus replication. The purpose of this study was cloning and expression of the human interferon alpha- 2b?gene in preplasmic space of Escherichia coli. Subjects and Methods: In this research, Alpha 2b interferon gene was cloned in a pET-26b(+) expression vector, under the control of T7 promoter and pelB periplasmic signal peptide sequence using NcoI and XhoI restriction enzymes. The expression vector was transformed into Escherichia coli strain BL21 (DE3).Cloning of alpha interferon gene confirmed using colony PCR, digestion and DNA sequencing.Gene expression of alpha interferon was examined by SDS-PAGE and Dot blot analysis. Also the possibility of periplasmic targeting was determined using SDS-PAGE and dot blot analysis at 15 hrs after induction. Results: The results showed that Alpha 2b interferon was produced in bacterial expression system and targeted to periplasmic space. Conclusion: Our study showed that the production of pharmaceutical recombinant protein in preplasmic space of bacterial expression system is fissible and can be ustilized as a cheaper source and more efficient than conventional expression systems.