افزايش بازدهي روش طبيعي استفاده از محيط اسپيزيزن براي انتقال پلاسميد به درون باكتري باسيلوس سوبتيليس با استفاده از يك پپتيد كاتيونيك تراوا كننده غشا باكتريايي

Increasing plasmid transformation efficiency of natural spizizen method in Bacillus Subtilis by a cell permeable peptide

مقدمه: تعدادي از گونه‌هاي باكتريايي قادرند تا مولكول DNA را از محيط اطرافشان در‌يافت نمايند؛ ميزان اين دريافت به شرايطي مانند بزرگي پلاسميد و نوع ميزبان بستگي دارد. در مورد باكتري باسيلوس سوبتيليس نيز اين امكان البته با ميزان انتقال بسيار پاييني وجود دارد. در حال حاضر روش مرسوم براي انتقال پلاسميد خارجي به درون باكتري باسيلوس سوبتيليس استفاده از روش طبيعي در يك محيط كشت حداقل (اسپيزيزن) است. در اين روش نيز ميزان انتقال مطلوب و در خور توجه نيست. هدف از اين مطالعه، بررسي تكنيكي نوين بر پايه پپتيد كاتيونيك CM11 به عنوان بك پپتيد تراوا كننده غشا ، براي افزايش موثر نرخ ترانسفورماسيون DNA به باكتري باسيلوس سوبتيليس است. مواد و روش‏‏ها: در اين روش، از پپتيد CM11 به عنوان عاملي براي بهينه‏سازي انتقال pWB980 به باكتري باسيلوس سوبتيليس استفاده شد. براي اين منظور، فرآيند مستعد‏سازي باسيلوس سوبتيليس با دو روش مجزا و در حضور غلظت‌هاي مختلف پپتيد انجام شد. بدين ترتيب كه در روش نخست، باكتري به مدت 14 ساعت در حضور غلظت‌هاي مختلف پپتيد تيمار شد و سپس در معرض پلاسميد قرار گرفت. در روش دوم، غلظت‏ها‏ي مختلف پپتيدي همراه با پلاسميد به شكل همزمان به باكتري عرضه شد. پس از غربال‏گري باكتري‏ها‏ي دريافت كننده پلاسيمد بر روي محيط كشت LB آگار حاوي آنتي بيوتيك كانامايسين تعداد كل باكتري‏ها‏ي ترانسفورم شده به ازاي هر ميكرو‏گرم DNA پلاسميدي محاسبه و با كنترل مقايسه شد. نتايج: انتقال پلاسميد pWB980 به باكتري در بهترين حالت معادل 5/6 برابر بيشتر از شرايط استاندارد (كنترل) گزارش شد كه از لحاظ آماري داراي اختلاف معني داري بود (P value < 0.001). بحث و نتيجه‏گيري: اين مطالعه نشان داد كه پپتيد CM11 به عنوان يك پپتيد تراوا كننده غشا سلولي مي‏تواند ترانسفورماسيون DNA خارجي به باكتري‌ باسيلوس سوبتيليس را به طور در خور توجهي بهينه نموده و تا حدود زيادي مشكل نرخ پايين انتقال طبيعي را برطرف نمايد.

Introduction: Some of bacterial species are able to uptake DNA molecule from environment, the yield of this process depends on some conditions such as plasmid size and host type. In the case of Bacillus subtilis, DNA uptake has low efficacy. Using Spizizen minimal medium is common method in plasmid transformation into B. subtilis, but rate of this process is not suitable and noteworthy. The aim of this study was investigation of novel method for improvement of DNA transformation into B. subtilis based on CM11 cationic peptide as a membrane permeable agent. Materials and methods: In this study, for optimization of pWB980 plasmid transformation into B. subtilis, the CM11 cationic peptide was used. For this purpose, B. subtilis competent cell preparation in the present of different concentration of peptide was implemented by two methods. In the first method, after treatment of bacteria with different amount of peptide for 14h, plasmid was added. In the second method, several concentration of peptide with plasmid was exposed to bacteria simultaneously. Bacteria that uptake DNA were screened on LB agar medium containing kanamycin. The total transformed bacteria per microgram of DNA was calculated and compared with the control. Results: Plasmid transformation in best conditions was 6.5 folds higher than the control. This result was statistically significant (P value < 0.001). Discussion and conclusion: This study showed that CM11 cationic peptide as a membrane permeable agent was able to increase plasmid transformation rate into B. subtilis. This property was useful for resolution of low transformation efficacy. Key words: Transformation, CM11 Peptide, pWB980, Bacillus subtilis