خالص‏سازي و تعيين ويژگي‏هاي آميلوپولولاناز مقاوم به حلال و نمك‏دوست خارج سلولي جدا شده از آركي نمك‏دوست Halorubrum سويه Ha25

Purification and characterization of an extracellular halophilic and organic solvent-tolerant amylopullulanase from a haloarchaeon, Halorubrum sp. strain Ha25.

مقدمه: نمك دوست ها، به ويژه هالوآركي ها يكي از مهم‏ترين گروه هاي ميكروارگانيسم هاي افراطي دوست هستند. هيدرولازهاي نمك دوست بسيار مطالعه شده اند و براي كاربردهاي صنعتي و زيست فن آوري مورد توجه هستند. با توجه به اهميت هيدرولازهاي نمك دوست، مطالعه حاضر اولين گزارش در مورد خالص سازي آنزيم آميلوپولولاناز از يك آركي نمك دوست است. مواد و روش‏‏ها: آركي نمك دوست Halorubrum سويه Ha25 آنزيم آميلوپولولاناز خارج سلولي نمك دوست و مقاوم به حلال را در غلظت بالاي نمك سديم كلرايد توليد مي كند. به منظور خالص سازي آنزيم، از رسوب-دهي پروتيين ها با حلال اتانول و كروماتوگرافي تعويض آنيوني استفاده شده وجرم مولكولي آنزيم بعد از تخليص، به كمك روش SDS-PAGE تعيين شد. بعد از تخليص آنزيم، ويژگي هاي آنزيم بررسي شد. به منظور تعيين پايداري آنزيم در حضور حلال هاي آلي، محلول آنزيمي به طور جداگانه در مجاورت هفت حلال آلي قرار گرفت. در انتها محصول عملكرد آنزيم روي دو سوبستراي نشاسته و پولولان به روش كروماتوگرافي لايه ي نازك بررسي شد. نتايج: جرم مولكولي آنزيم به كمك روش SDS-PAGE به ميزان kDa 140 تعيين شد. بيشينه ي فعاليت آميلوليتيك و پولوليتيك آنزيم در دماي 50 درجه سانتي‏گراد بود. اسيديته بهينه براي فعاليت آميلوليتيكي 0/7 و براي فعاليت پولوليتيكي 5/7 تعيين شد. آنزيم در محدوده وسيع غلظتي صفر تا 5/4 مولار از نمك NaCl فعال بود. اثر حلال هاي آلي مختلف روي فعاليت پولوليتيك و آميلوليتيك آنزيم آميلوپولولاناز نشان داد كه آنزيم در حضور حلال هاي غير قابل اختلاط با آب داراي پايداري بيشتري نسبت به حلال هاي قابل اختلاط با آب است. تنها محصول عملكرد آنزيم روي هر دو سوبستراي نشاسته و پولولان، گلوكز تعيين شد. بحث و نتيجه‏گيري: آركي نمك دوست Halorubrum سويه Ha25، آنزيم آميلوپولولاناز نمك دوست و گرمادوست را توليد مي كند. با توجه به فعاليت آنزيم در شرايطي نظير دما و شوري بالا و آب فعال كم، اين آنزيم گزينه اي مناسب به منظور كاربردهاي زيست فن آوري، نظير تيمار پسآب هاي داراري شوري بالا، حلال-هاي آلي و تركيبات نشاسته اي است.

Introduction: Halophiles, especially haloarchaea are one of the most important groups of extremophiles. Halophilic hydrolases have been studied worldwide and have been considered for biotechnology and industrial technologies. This study is the first report in amylopullulanase production in halophilic microorganisms. Materials and methods: A halophilic archaeon, Halorubrum sp. strain Ha25, produced extracellular halophilic organic solvent-tolerant amylopullulanase. The enzyme was purified using ethanol precipitation and anion exchange chromatography method. Molecular mass of purified enzyme was determined by SDS–PAGE method. After purification, the enzyme was characterized. To study the effects of organic solvents in the stability of the enzyme, the enzyme solution was incubated in the presence of various organic compounds and then, residual enzyme activity was measured. Mode of action of the enzyme was determined by thin-layer chromatography. Results: Molecular weight of the purified enzyme was estimated to be 140 kDa by SDS–PAGE method. Optimum temperature for amylolitic and pullulytic activities was 50 °C. Optimum pH for amylolitic activity was 7.0 and for pullulytic activity was 7.5. This enzyme was active over a wide range of concentrations (0-4.5 M) of NaCl. The effect of organic solvents on the amylolitic and pullulytic activities showed that this enzyme was more stable in the presence of non-polar organic solvents than polar solvents. The enzyme solely hydrolyzed pullulan and soluble starch to glucose. Discussion and conclusion: Halorubrum sp. strain Ha25 produces thermophilic and extremely halophilic amylopullulanase. The catalytic function under multi extreme condition of high temperature, high salinity, and low water activity might possess biotechnological and commercial values such as treatment waste solutions with starch residues, high salt content and solvents. Key words: Halophilic amylopullulanase, Protein purification, Extreme halophilic archaea, Halorubrum, Organic solvent-tolerance