همسانه‌سازي، آناليز بيان و بررسي روابط خويشاوندي ژن dbat از گياه سرخدار بومي ايران (Taxus baccata L.)

Cloning, Gene Expression Analysis, and Phylogenic Relationship of dbat Gene from Iranian Endemic Yew (Taxus baccata L.)

مقدمه: تاكسول يكي از مهم‌ترين داروهاي ضدسرطان مي‌باشد كه تامين آن عمدتاً به روش‌هاي زيستي وابسته مي‌باشد. ژن 10- داستيل باكاتين III – اُ- استيل ترانسفراز (dbat) يكي از ژن‌هاي كليدي مسير بيوسنتزي تاكسول مي‌باشد و مي‌توان انتظار داشت افزايش بيان آن منجر به افزايش توليد تاكسول در سيستم‌هاي زيستي شود.‌ هدف: بررسي ويژگي‌هاي ژن dbat از سرخدار بومي ايران، آناليز بيان ژن و تهيه سازه افزايش بيان ژن مذكور. روش‌ بررسي: ابتدا توالي ژن كلون شد. خصوصيات توالي با استفاده از بررسي‌هاي بيوانفورماتيكي مشخص شد. آناليز بيان ژن در پاسخ به اليسيتور متيل جاسمونات و در زمان‌هاي مختلف انجام شد. در نهايت به منظور تهيه سازه افزايش بيان، توالي تحت كنترل پروموتر CaMV35S وكتور pCAMBIA1304 كلون شد. نتايج: مقايسه درجه شباهت توالي مشخص نمود كه توالي مذكور بيشترين مشابهت را با توالي Taxus × hunnewelliana نشان مي‌دهد. يك جايگزيني اسيد آمينه‌اي منحصر به فرد در توالي مشاهده شد كه بررسي آن نشان داد كه تغيير مذكور نمي‌تواند خصوصيات كلي آنزيم را تغيير دهد و بنابراين آنزيم حاصل يك آنزيم فعال مي‌باشد. آناليز بيان ژن نشان داد كه در پاسخ به متيل جاسمونات سطوح بيان ژن به ميزان حداكثر 24 برابر در 12 ساعت پس از تحريك افزايش مي‌يابد. در پايان، درج ژن مذكور در جايگاه مناسب وكتور افزايش بيان توسط آزمون‌هاي هضمي مورد تاييد قرار گرفت.‌ نتيجه‌گيري: تحريك سرشاخه‌هاي بريده گياه سرخدار مي‌تواند روش جايگزين مناسبي براي كشت‌هاي سلولي سرخدار به منظور بررسي‌هاي بيان ژن باشد. سادگي، سهولت و حذف مرحله زمانبر كشت‌هاي سلولي از مهم‌ترين مزاياي آن مي‌باشد.

Background: Taxol is one of the most important anticancer agents that its supply mainly depends on biological processes. 10 - deacetyl baccatin III- O- acetyl transferase (dbat) gene is one of the key genes in Taxol biosynthetic pathway and it is expected that overexpression of this gene would result in an increased production of taxol in biological systems. Objective: Investigation of dbat gene characteristics from Iranian endemic yew, Gene expression analysis and Construction of overexpression vector for this gene. Methods: First, sequence of the gene was cloned and then, sequence characteristics identified with Bioinformatics analysis. Gene expression analysis was performed under methyl jasmonate elicitation in several time-courses. Finally in order to construct overexpression vector, the sequence was cloned under the control of the CaMV35S promoter in to pCAMBIA1304. Results: Comparison of sequence similarities indicated that this sequence is most similar to Taxus × hunnewelliana. There was one unique amino acid substitution and investigating substituted amino acid revealed that, this replacement can not change overall characteristics of the enzyme and thus it would result in a functional enzyme. Analysis of gene expression showed that in response to methyl jasmonate, gene expression levels increased to maximum rate up to 24 times at 12 hours after elicitation. Finally gene insertion in suitable site of overexpression vector, confirmed by digest with restriction enzymes. Conclusion: Elicitation of shoot cuttings of Taxus would be a suitable alternative for Taxus cell cultures in gene expression analysis. Simplicity, feasibility, and deletion of time-consuming processes of cell culture are its main advantages.