مهندسي پروتيين آنزيم اندوگلوكاناز قارچي از طريق ايجاد جهش هدفمند به‌منظور بهبود خصوصيات آنزيمي و بيان آن در مخمر

Endoglucanase enzyme protein engineering by site-directed mutagenesis to improve the enzymatic properties and its expression in yeast

زمينه: استفاده از سوخت‌هاي فسيلي باعث افزايش بهاي آن و كاهش منابع شده ‌است. لذا منابع تجديدپذير انرژي و توليد سوخت‌هاي زيستي مورد ‌‌توجه ‌قرار‌ گرفته ‌است. تركيبات سلولزي از مناسب‌ترين مواد اوليه براي توليد سوخت‌هاي زيستي مي‌باشد. تجزيه سلولز تنها توسط ميكروارگانيسم‌هايي كه حاوي آنزيم سلولاز هستند، انجام‌پذير است كه مهم‌ترين آن‌ها قارچ Trichoderma reesei مي‌باشد. روش‌ها: توالي نوكليوتيدي آنزيم‌ اندوگلوكاناز II كه از كليدي‌ترين آنزيم‌هاي اين كمپلكس‌ و آغازگر حمله به زنجيره سلولزي است، از روي توالي آمينواسيدي آن در قارچT.reesei براساس ترجيح كدوني ميزبان يعني مخمر پيكياپاستوريس سنتز شد. به‌منظور توليد آنزيم‌هاي بهينه و كاهش زمان توليد و بهاي آنزيم از مهندسي پروتيين استفاده مي‌شود و از انواع آن ايجاد‌ جهش‌ هدفمند است كه در آن جايگزيني آمينواسيدها صورت‌مي‌گيرد. در اين تحقيق با كمك روش ايجاد جهش‌ هدفمند، دو جهش در ژن آنزيم اندوگلوكاناز II از طريق PCR ايجاد شد كه در آن دو سيستيين آزاد شماره 169 و 393 به‌ترتيب به آمينواسيدهاي والين و هيستيدين تبديل‌شدند. سپس اين ژن جهش‌يافته به پلازميد‌بياني pPink? وارد و جهت تكثير به باكتري اشرشياكلاي و سپس از طريق الكتروپوريشن به مخمر پيكياپاستوريس منتقل‌شد. يافته‌ها: ايجاد دوجهش مذكور بر روي اين ژن از طريق تعيين توالي تاييد‌ شد. حضور آنزيم پس‌ از بيان ژن موردنظر در محيط BMMY، با تست دي‌نيتروساليسيليك‌اسيد و ژل SDS-PAGE اثبات‌گرديد. نتيجه‌گيري: با بررسي خصوصيات بيوشيميايي نشان داده ‌شد كه دو جهش ايجادشده به‌طور همزمان در مقايسه با آنزيم فاقد جهش، باعث كاهش قدرت كاتاليتيكي و پايداري حرارتي و افزايش ميل تركيبي آنزيم و سوبسترا شده‌ است.

Introduction: Fossil fuel is an expensive and finite energy source. Therefore, the use of renewable energy and biofuels production has been taken into consideration. One of the most suitable raw materials for biofuels is cellulosic compounds. Only microorganisms that contain cellulose enzymes can decompose cellulose and fungus of Trichodermareesei is the most important producer of this enzyme. Methods: In this study the nucleotide sequence of endoglucanase II, which is the starter of attack to cellulose chains, synthesized from amino acid sequence of this enzyme in fungus T.reesei and based on codon usage in the host; yeast Pichiapastoris. To produce optimized enzyme and to decrease the production time and enzyme price, protein engineering will be used. There are some methods to improve the enzymatic properties like site-directed mutagenesis in which amino-acid replacement occur. In this study two mutations were induced in endoglucanase enzyme gene by PCR in which free syctein positions 169 and 393 were switched to valine and histidine respectively. Then this gene was inserted into the pPinka expression vector and cloned in Escherichia coli. The recombinant plasmids were transferred into P.pastoris competent cells with electroporation, recombinant yeasts were cultured in BMMY medium and induced with methanol. Results: The sequencing of gene proved the induction of the two mutations and the presence of recombinant enzyme was confirmed by dinitrosalicilic acid method and SDS-PAGE. Conclusion: Examination of biochemical properties revealed that the two mutations simultaneously decreased catalytic power, thermal stability and increased the affinity of enzyme and substrate.