طراحي و مطالعه بيوانفورماتيكي ژن موتانت زير واحد كاتاليتيك ديفترياتوكسين (dtxA)و بررسي بيان پروتيين نوتركيب كانديد واكسن عليه ديفتري

Designing and Bioinformatics Study of Synthetic Mutated Diphtheria Toxin(dtxA) Catalytic Domain Gene and Survey of its Recombinant Protein Exprassion as Vaccine Candidate

چكيده مقدمه:ديفتري ناشي از باسيل كورينه باكتريوم، بيماري مهلكي است كه بقراط در 5 قرن قبل از ميلاد آن را شرح داده است. عامل بيماري، اگزوتوكسين DTX، شامل دو زنجيره كاتاليتيك(A) و اتصال دهنده(B) مي باشد. بخش A پس از ورود به سلول به واسطه اتصال بخش B كه به بسياري از سلول هاي بدن، باعث مهار سنتز پروتيين و مرگ سلول مي گردد. هدف از اين مطالعه طراحي و تهيه ژن موتانت زيرواحد كاتاليتيك ديفترياتوكسين(dtxA) و بررسي هاي بيوانفورماتيكي آن به منظور بررسي بيان در وكتور pET28a و توليد پروتيين نوتركيب حاصل از آن، به عنوان كانديد واكسن عليه ديفتري مي باشد. مواد و روش ها: پس از تعيين و بهينه سازي ترادف ژن dtxA واجد جهش هاي G52E / A158G و بررسي هاي بيوانفورماتيكي سازه ژني dtxA pET28a/ به ميزبان بياني E.Coli Bl21 DE3 منتقل گرديد. سپس بيان و توليد پروتيين نوتركيب حاصل به عنوان كانديد واكسن، با كمك وسترن بلات مورد ارزيابي قرار گرفت. يافته هاي پژوهش: نتايج بيوانفورماتيكي حاصل از بهينه سازي كدون هاي ژن مورد مطالعه منجر به سفارش و تهيه اين ژن در وكتور بياني گرديد. صحت اين ژن با كمك واكنش هضم آنزيمي و الكتروفورز، مورد تاييد قرار گرفت. پس از آن بيان و توليد اين پروتيين نوتركيب با وسترن بلات تاييد گرديد. بحث و نتيجه گيري: با توجه به مزيت هاي پروتيين نوتركيب DTxA به توكسوييد ديفتري، به نظر مي آيد پروتيين نوتركيب حاصل مي تواند جايگزيني مناسب به عنوان كانديد واكسن عليه ديفترياتوكسين قرار گيرد كه نيازمند مطالعات بيشتر مي باشد.

Introduction: Diphtheria, caused by a toxic-ogenic strain of Corynebacterium diphther-ia, is a fatal disease that was characterized by Hippocrates in 5 BC. Exotoxin (dTX) is the causative agent of this lethal disease. Diphtheria toxin consists of two chains, catalytic (A) and binding (B) chains. The toxin binds to its receptor through binding chain (B) and enters into many host cells such as myocardial, kidney and peripheral nerve cells. After entering, the catalytic chain (A) inhibits protein synthesis and lead to the death of target cell. Currently, a toxoid form of diphtheria toxin is used as vaccine. The aim of this study was to des-ign and provide a mutated catalytic subunit of diphtheria toxin. After studying the mu-tant protein through bioinformatics meth-ods, we sought to express its gene in the vector, pET28a, and produce this toxoid as a candidate recombinant vaccine against diphtheria. Materials & Methods: After determining and optimizing of the sequence of dtx gene containing two mutations (A158G, G52E), and performing its bioinformatics study, th-is synthetic gene was introduced in an ex-pression vector and appropriate molecular analysis was carried out. The pET28a/dtxA construct was transformed in Bl21DE3 E.coli. Then, recombinant protein expre-ssion and production as a vaccine candidate was evaluated by western blotting techn-ique. Findings: The bioinformatics results obtain-ed through optimizing the codons of the gene under study lead to synthesis of the gen in the expression vector. The molec-ular analysis of this gene by restriction dig-estion and electrophoresis confirmed its accuracy. The protein product of the gen was confirmed by western blotting after expression and production. Discussion & Conclusion: Given to the advantages of DtxA recombinant protein compared to diphtheria toxoid, it is conc-eived that this recombinant protein, as a vaccine candidate, the conventional diphth-eria vaccine could be replaced with the rec-ombinant vaccine. This issue should be co-rroborated by further researches.