توليد آنتي بادي پلي كلونال عليه ناحيه 4-2 آنتي ژن محافظت كننده باسيلوس آنتراسيس در حيوانات آزمايشگاهي

Production of polycolonal antibody against domain 2-4 of protective antigen of Bacillus anthracis in laboratory animals

زمينه و هدف: آنتراكس كه مسبب آن باكتري باسيلوس آنتراسيس مي‌باشد يك بيماري عفوني حاد است و اغلب در گياه‌خواران و انسان اتفاق مي‌افتد. فرم رويشي باسيلوس آنتراسيس يك اگزوتوكسين سه جزيي شامل آنتي ژن حفاظت كننده (Protective Antigen=PA)، فاكتور كشنده (Lethal Factor=LF) و فاكتور ادم (Edema Factor=EF) مي‌باشد. آنتي ژن حفاظت كننده به عنوان يك ايمونوژن اوليه براي توسعه ايمني حمايتي بر عليه آنتراكس بررسي شده است. اين مطالعه با هدف توليد آنتي بادي عليه ناحيه 4-2 آنتي ژن حفاظت كننده اين باكتري در حيوانات آزمايشگاهي طراحي و اجرا شده است. روش بررسي: در اين مطالعه تجربي ناحيه 4-2 ژن PA از پلاسميد pXOI با جايگاه هاي آنزيمي BamHI و HindIII به روش PCR تكثير و در وكتورها كلون و ساب كلون شد. وكتور (pET28a(+ در باكتري اشرشياكلي سويه BL21(DE3) ترانسفورم گرديد. بعد از القا با IPTG، بيان پروتيين ژن PA مشاهده شد. پروتيين تخليص شده در 4 نوبت به موش و خرگوش تزريق شد؛ سپس آنتي بادي توليد شده از سرم موش و خرگوش جداسازي و توسط آزمون الايزا تاييد گرديد. يافته ها: ناحيه 4-2 ژن PAكلون شده در وكتور بياني pET28a(+) به وسيله ي توالي يابي، PCR، آناليز آنزيمي، الكتروفورز در ژل پلي اكريل آميد و لكه گذاري وسترن مورد تاييد قرار گرفت. افزايش تيتر آنتي بادي در خون موش و خرگوش توسط آزمون الايزا تاييد گرديد. نتيجه گيري: با توجه به ايمونوژن بودن پروتيين PA، مي‌توان از آن در طراحي واكسن و همچنين به عنوان ادجوانت قوي سيستم مخاطي استفاده نمود.

Background and aims: Anthrax caused by bacillus anthracis, is an acute infectious disease that mostly occurs in herbivorous animals and in human. The vegetative format Bacillus anthracis is an exotoxin, which consists of three polypeptide: protective antigen (PA, 83 kDa), lethal factor (LF, 90 kDa) and edema factor (EF, 89kDa). PA is considered as a primary immune gen for development of protective immunity against anthrax. The aim of this study was the production of antibody raised against domain 2-4 PA in lab animals. Methods: In this experimental study, domain 4-2 PA gene of plasmid pXOI with BamHI and HindIII restriction enzyme sites, amplified by PCR and were cloned and sub cloned in the vectors. Vector pET28a (+) was transformed to E. coli strain BL21 (DE3). After induction with IPTG, PA gene expression was observed. Purified protein was injected in mice and rabbits 4 times. Then the raised antibody was isolated from mice and rabbits sera and confirmed by ELISA. Results: The pET28a (+)/domain 2-4 expression vector confirmed by end nuclease digestion, PCR and sequence analysis. The expression product domain 2-4 was confirmed by SDS-PAGE and Western blot. Antibody in mice and rabbits sera was confirmed by ELISA. Conclusion: Due to PA protein being immunogenic, it could be used for vaccine design and as a powerful mucosal adjuvant system.