بيان، تخليص و بررسي عملكرد ناحيه‏ كينازي گيرنده‏ نوتركيب عامل رشد فيبروبلاستي 2bانساني

Expression, purification and evaluation of the recombinant human fibroblast growth factor receptor 2b kinase domain

زمينه: گيرنده‏ عامل رشد فيبروبلاستي 2b (FGFR2b) در مسير پيام‏رساني سلولي و تنظيم فرايندهاي مهم زيستي از جمله تمايز و تكثير سلولي نقش اساسي دارد. تغييرات ژنتيكي نظير جهش نقطه‏اي در ناحيه تيروزين كينازي FGFR2b با سرطان پستان، تخمدان و رحم در ارتباط است. هدف: مطالعه به منظور بيان و خالص‏سازي مقدار مناسبي از ناحيه كينازي FGFR2b انساني انجام شد. مواد و روش‏ها: اين مطالعه تجربي در سال 1392 در دانشگاه علوم پزشكي قزوين انجام شد. پلاسميد pLEICS-01 كه حاوي ژن ناحيه‏ تيروزين كينازي پروتيين نوتركيب FGFR2b بود به باكتري مستعد اشرشياكليBL21 جهت بيان ژن مورد نظر انتقال داده شد. بيان پروتيين نوتركيب با استفاده از IPTG يك ميلي‏مولار القا و با استفاده از الكتروفورز روي ژل پلي‏آكريل آميد در حضور SDS (SDS-PAGE) ارزيابي شد. پروتيين بيان شده با استفاده از كروماتوگرافي ميل تركيبي توسط ستون حاوي Ni2+-NTA خالص شد. فعال بودن نمونه پروتيين بعد از دياليز توسط تعامل با ناحيه SH2 فسفوليپاز C (PLC) طبيعي و موتان توسط روش PAGE بررسي شد. داده ها با آزمون هاي آماري واريانس يك طرفه و توكي تحليل شدند. يافته‏ها: بررسي SDS-PAGE قبل و بعد از القا شدن نشان داد كه پروتيين بيان شده در دماي 20 درجه سانتي گراد محلول بود. همچنين بررسي SDS-PAGE تاييد كرد كه پروتيين خالص شده عاري از آلودگي بود و پروتيين هاي باكتريايي نداشت. نتايج PAGE فعال بودن پروتيين خالص شده را تاييد كرد. نتيجه‏گيري: باتوجه به يافته ها، ناحيه‏ كينازي گيرنده‏ نوتركيب عامل رشد فيبروبلاستي 2b كه يك پروتيين 38 كيلودالتوني است، توليد و خالص شد كه به صورت محلول و فعال بود.

Background: Fibroblast growth factor receptor 2b (FGFR2b) plays an important role in cell signaling pathway and regulating several key biological processes including cellular differentiation and proliferation. Genetic alterations (e.g. point mutation in FGFR2b tyrosine kinase domain) are associated with breast cancer, ovarian cancer, and endometrial cancer. Objective: The aim of this study was to express and purify the recombinant human FGFR2b kinase domain. Methods: This experimental study was conducted in Qazvin University of Medical Sciences during 2013. Recombinant pLEICS-01 vectors containing the FGFR2b tyrosine kinase domain gene were transformed into E. coli BL21 (DE3). Recombinant protein expression was induced with 1mM IPTG and analyzed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The recombinant protein was purified by Ni2+-NTA affinity chromatography. After dialysis, the protein activity was evaluated by interaction with the wild type and mutant SH2 domains of phospholipase C (PLC) using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Data were analyzed using One-way ANOVA and Tukey’s test. Findings: Pre and post-induction SDS-PAGE analysis showed that the expressed protein was soluble at 20 ?C. SDS-PAGE analysis also confirmed that no contamination and bacterial proteins were co-eluted with the purified protein. PAGE method results confirmed that the purified protein was in an active state. Conclusion: With regards to the results, the recombinant FGFR2b kinase domain-a 38 kDa protein- was expressed and purified in an active and soluble state.