تكثير، همسانه سازي و بررسي امكان بيان ژن زيرواحد فرعي آنتي ژن عامل كلونيزاسيون I (CFaE) از باكتري اشريشياكولي انتروتوكسيژنيك (ETEC)

Amplification, Cloning and Expression Assay of the minor subunit Colonization Factor Antigen I (CFaE) from Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC)

باكتري اشريشيا كلي انتروتوكسي‍‍ژنيك (ETEC) شايع ترين عامل اسهال باكتريايي كودكان زير پنج سال و همچنين رايج ترين عامل اسهال مسافر در بالغين در دنيا است، كه سالانه تعداد زيادي از كودكان را به كام مرگ كشانده و تعداد كثير ديگري را تحت تاثير قرار مي دهد. از اين رو هدف WHO توليد واكسن عليه اين عامل مي باشد. فيمبريه CFA/I يكي از عوامل ويرولانس مهم و شايع اين باكتري است كه نقش اساسي در فرآيند بيماريزايي اين باكتري دارد. از اين رو پروتيين انتهايي اين فيمبريه (CFaE) مي تواند به عنوان كانديد واكسن مطرح باشد. هدف از اين مطالعه، بررسي امكان بيان پروتيين نوتركيب CFaE از توالي طبيعي ژن مربوطه بعد از همسانه سازي آن در ناقل بياني، بوده است. بعد از طراحي پرايمر براي ژن cfaE ، با استفاده از واكنش PCR تكثير شد. در مرحله بعد، ژن مذكور در ناقل pTZ57R/T همسانه سازي اوليه و سپس با استفاده از آنزيمهاي محدودالاثر در ناقل بياني pET28a(+) زير همسانه سازي شد. بررسي بيان با استفاده از ماده IPTG با تغيير پارامترهاي مختلف صورت گرفته در دو ميزبان E.coli سويه هاي BL21(DE3)pLysS و Rosetta مورد ارزيابي قرار گرفت. فرآيند همسانه سازي و زير همسانه سازي با موفقيت انجام گرفت. نمونه هاي تست در مقايسه با كنترل در مواجهه با IPTG پروتيين نوتركيب قابل تشخيصي را روي ژل SDS-PAGE نشان نداد. اين نتيجه با تغيير پارامترهاي مختلف (زمان القا ، دما و غلظتهاي متفاوت IPTG) تكرار شد. به نظر مي رسد توالي طبيعي ژن cfaE داراي ميزان A+T بالا و همچنين كدونهاي نادر زيادي است كه باعث مي شود قابليت توليد بالاي پروتيين در E.coli با اين الگوي كدوني وجود نداشته باشد. از اين رو پيشنهاد مي گردد توالي اين ژن بعد از بهينه سازي كدونها ، سنتز شده و سپس بررسي بيان آن مجدداً ارزيابي شود.

Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) is the most common cause of bacterial diarrhea in children under 5 years and it is also a cause of Travelers diarrhea worldwide. To prevent ETEC-caused diarrhea and decrease its prevalence, the WHO has promoted the vaccine production against this pathovar. CFA/I fimbriae is an important and frequent virulence factor of this bacteria, playing a critical role in pathogenesis. Therefore, tip protein of this fimbriae (CFaE) could describe as a vaccine candidate. This study was aimed at investigating the expression of the gene rCFaE from native sequence after cloning into expression vector. rCFaE was amplified by PCR using a newly designed set of primers. PCR product was then cloned into early cloning vector pTZ57R/T and then sub cloned into the expression vector pET28a(+). Protein expression in 2 strains of E.coli BL21 (DE3) pLysS and Rosetta was determined by using IPTG under different conditions. cloning and sub cloning process were performed successfully. Test samples in the comparatives with control samples did not show detectable protein on the SDS-PAGE. The same results were obtained after changing different parameters like time and temperature of induction and variety of IPTG concentration. It was not possible to obtain high level expression of the target recombinant protein production in E.coli with pattern codon usages, probably due to the high A+T content and also abundance rare codons in the native sequence of cfaE gene. Therefore we suggest synthesizing this gene after codon optimization and checking for expression that again.