بررسي بيان ميني ژن‌هاي فاكتور 9 انساني در سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي مغز استخوان

Expression of the human coagulation factor IX in the bone marrow mesenchymal stem cells

زمينه:سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي هدف مناسبي جهت سلول درماني و ژن درماني بيماران هموفيلي B محسوب مي‌شوند. اين سلول‌ها داراي ويژگي‌هاي بي‌نظير از جمله تمايز به طيف وسيعي از سلول‌هاي مختلف و ايمني‌زايي اندك در شرايط پيوند مي‌باشند كه آن‌ها را براي سلول درماني و ژن درماني مناسب كرده است. بيان اندك ترانس ژن از مشكلات ژن درماني است. با شناسايي توالي‌هاي تنظيمي و استفاده از آن‌ها در موقعيت‌هاي مناسب در ناقلين مي‌توان در جهت بهبود بيان ژن با هدف ژن درماني اقدام نمود. در اين بررسي، 4 ناقل پلاسميدي فاكتور 9 فاقد و واجد اينترون‌هاي ژن بتاگلوبين به درون سلول‌هاي مزانشيمي ترانسفكت گرديدند. هدف اين پژوهش بررسي توانايي اين سلول‌ها در بيان فاكتور 9 بود. مواد و روش‌ها: پس از جداسازي سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي از استخوان تيبيا و فمور موش رت، فنوتيپ اين سلول‌ها با روش فلوسايتومتري تعيين شد. ناقلين پلاسميدي فاكتور 9 با استفاده از عامل ترانسفكشن به درون سلول‌هاي مزانشيمي وارد شدند. 48 ساعت پس از ترانسفكشن، توانايي سلول‌هاي بنيادي در بيان ميني ژن‌هاي مختلف فاكتور 9 از طريق انجام آزمون ساندويچ الايزا بر روي محيط كشت و آزمون RT-PCR ارزيابي شد. براي تجزيه و تحليل آماري از نرم‌افزار SPSS ويرايش 18 استفاده شد. مقايسه ميانگين داده‌ها با استفاده از آزمون آناليز واريانس يك طرفه (One – Way ANOVA) انجام شد. يافته‌ها:بالاترين سطح بيان فاكتور 9 از سازه ژني بدون اينترون و سازه ژني داراي اينترون 1 ژن بتاگلوبين به‌دست آمد.بالاترين ميزان فعاليت زيستي از فاكتور9 ترشح شده به محيط كشت از سازه ژني داراي اينترون 1 و 2 بتا گلوبين به‌دست آمد. نتيجه‌گيري:سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي توانايي بيان فاكتور 9 و اسپلايسنگ اينترون 1 ژن بتاگلوبين را نشان دادند. توالي‌هاي اينتروني بتاگلوبين سطح بيان فاكتور 9 را كاهش دادند كه اين كاهش بيان را مي‌توان با احتمال به اسپلايسينگ نادرست اينترون‌ها نسبت داد.

Background: Mesenchymal stem cells (MSCs) are appropriate target for gene and cell-based therapy of hemophilia B patients. MSCs possess several unique properties such as capability of differentiating into multiple lineages and lower immunogenecity in transplant procedure that make them attractive candidates for cell and gene therapy. One of the challenges in the gene therapy is the low expression level of transgene. To improve expression, strong regulatory elements in the context of vectors could contribute to improve efficacy of gene therapy strategies. In this study four human factor IX (hFIX)-expressing plasmids equipped with various combination of human ?-globin (hBG) introns and Kozak sequence were transfected into the MSCs and expression of the hFIX was evaluated in vitro. Material and Methods: MSCs were obtained from tibias and the femora of rats and phenotypic characterization of the MSCs was determined by flow cytometry. Four hFIX-expressing plasmids were introduced into the culture-expanded MSCs using transfection agent. 48 hours after transfection, ability of the MSCs for expression of the hFIX and efficacies of the plasmids were evaluated by performing sandwich ELISA on cultured media as well as semi-quantitative RT-PCR. All analyses were performed with One-way ANOVA using SPSS software. Results:The highest expression level of the hFIX was obtained from intron-less and hBG intron-I containing construct. The highest biological activity was obtained from hBG intron-I,II containing construct. Conclusion:Successful expression of the hFIX was obtained from recombinant MSCs. MSCs were able to splice heterologous hBG intron-I from the hFIX-cDNA. Application of thehBG introns reduced the hFIX expression levels, probably due to improper splicing of the hBG introns.