ارزيابي فراواني زيرگونه‌هاي ژيارديالامبليا به روش PCR-RFLP در نمونه‌هاي مدفوع كودكان بستري شده در مركز آموزش و درماني مطهري شهر اروميه

EVALUATION OF FREQUENCY OF GIARDIA LAMBLIA SUB SPECIES BY PCR-RFLP IN HOSPITALIZED CHILDREN,S STOOL SPECIMENS IN URMIA MUTAHHARI HOSPITAL

پيش زمينه و هدف: ژيارديا لامبليا يكي از شايع‌ترين پروتوزواهاي تاژكدار روده‌اي است كه گروه وسيعي از ميزبانان مهره‌دار را آلوده مي‌كند. ژيارديا يكي از معمول‌ترين پاتوژن‌هاي روده‌اي در بچه‌هاست كه باعث اختلالات شديد روده‌اي و تاخير در رشد مي‌شود.اين مطالعه براي تعيين زيرگونه‌هاي ژيارديالامبليا به وسيله روش PCR-RFLP با استفاده از ناحيه گلوتامات دهيدروژناز از كودكان بستري شده در بيمارستان مطهري اروميه، آذربايجان غربي در ايران انجام گرفت. مواد و روش‌ها: در اين مطالعه، 34 نمونه مدفوع از كودكان بستري شده در بيمارستان مطهري اروميه كه با استفاده از ميكروسكوپ نوري داراي كيست‌هاي ژيارديا بودند جمع‌آوري شد. كيست‌ها به طور نسبي به وسيله روش گراديان سوكروز تغليظ و سپس جهت حذف موثر مهار كننده‌هاي PCR، به وسيله آب مقطر استريل شستشو داده شد. DNA ژنوميك انگل ژيارديا به وسيله سيكل‌هاي انجماد و ذوب كردن و سپس روش فنل كلروفرم استخراج شد. براي تمايز زيرگونه‌هاي A، B كه در انسان‌ها يافت مي‌شود يك آزمايش PCR-RFLP تك مرحله‌اي انجام گرفت. در اين روش يك قطعه‌اي به اندازه432 bp مورد انتظار بود، تكثير يافت و سپس براي تعيين زيرگروه‌هاي انگل، از آنزيم‌هاي محدود كننده اختصاصي RsaI، BspL1 استفاده شد. يافته‌ها: از 720 نمونه بررسي شده ميكروسكوپي، به طور كلي 34 نمونه از نظر وجود كيست ژيارديا مثبت بودند كه ميزان شيوع انگل 72/4درصد گزارش شد.آزمايش PCR-RFLP بر روي اين نمونه‌ها آشكار كرد كه 28 نمونه (3/93%) داراي ژنوتايپ BIII و دو نمونه (7/6%) متعلق به زير گروه BIV مي‌باشد. نتيجه گيري: PCR-RFLP يك روش قوي و قابل اعتمادي است كه ما را در تعيين موثر ژنوتايپ در بين زيرگونه‌هاي ژيارديا با استفاده از ژن ناحيه گلوتامات دهيدروژناز ميسر ساخته و شناسايي وجود ژنوتايپ‌هاي مخلوط را ممكن مي‌سازد. بر اساس نتايج يك منشا حيواني از عفونت پيشنهاد مي‌شود.

Background & Aims: Giardia lamblia is one of the most prevalent intestinal flagellate protozoan that infects a wide range of vertebrate hosts. Giardia is one of the most common intestinal pathogens in children causing sever intestinal disorder and growth retardation. This study was performed to determine subspecies of Giardia lamblia by the PCR-RFLP method, targeting the glutamate dehydrogenase(gdh) locus, in hospitalized children at the Urmia Mutahhari hospital, West Azarbaijan Province, Iran Methods: In this study, thirty four stool specimen were collected from the hospitalized children in Urmia Motahhari hospital and dgiardia cysts were detected using microscopy. Cysts were partially purified by the sucrose density gradient method and then washed with sterile distilled water to effectively remove the PCR inhibitors. Genomic DNA of G.lamblia isolates was extracted by freeze-thaw cycles followed by phenol/ chloroform/isoamyl alcohol method. A single step PCR-RFLP assay was used to differentiate the assemblages A and B which been found in humans. In this method, 432 bp expected size were amplified and then for detection sub species were used of specific restriction RsaI and BspLI enzymes. Findings: From 720 examined samples, totally 34 samples were positive in term of giardia cyst so the parasite spread rate was reported 4.72%. Analysis of PCR-RFLP on these samples revealed that 28 samples (93.3%) had the genotype BIII and two samples (6.7%) belonged to the subgroup BIV. Conclusions: PCR-RFLP is a rapid and reliable method that enables us to effective genotype discrimination within Giardia assemblages using glutamate dehydrogenase gene, and makes it possible to identify the presence of mixed genotypes. In the base results, an animal source of infection is suggested. Keywords: Giardia, Glutamate dehydrogenase, PCR-RFLP