طراحي و بهينه سازي روش PCR تك واكنشي چندگانه‌ي آشيانهاي به منظور غني سازي محصول PCR در تشخيص بروسلا

Design and optimization of single reaction Multiplex Nested PCR for enrichment of PCR product in detection of Brucella

باكتري جنس بروسلا يكي از عوامل اصلي بيماريهاي مشترك انسان و دام است. تشخيص گونههاي بيماريزا در كشورهاي مختلف حايز اهميت است. در اين بررسي سه نوع نمونه شامل باكتري خالص، شير و سرم بيماران مشكوك به بروسلوز مورد بررسي مولكولي قرار گرفت. آزمونها روي30 نمونه خون بيمار مبتلا به بروسلوز و همچنين 100 نمونه شير جمعآوري شده از دامداران سنتي كه بهطور تصادفي انتخاب شده بود؛ انجام و براي تاييد دو نمونه از محصولات واكنش PCR تعيين توالي شد. استخراج DNA با بهكارگيري روش SDS/NET/Proteinase-k و سپس فنل – كلروفرم انجام شد. وجود بروسلا مليتنسيس در 22 مورد (3/73 درصد) بيماراني كه تستهاي سرولوژي مثبت بروسلوز داشتند و 14 نمونه از شيرهاي جمعآوري شده (14 درصد) تاييد شد؛ هرچند مثبت بودن تستهاي مولكولي در حيوانات واكسينه شده نيز بايد در نظر گرفته شود. با بهكارگيري پرايمرهاي اختصاصي براي تكثير يك ناحيه از ژن omp31 گونههاي مختلف بروسلا در واكنش PCR اول و در پي آن بهكارگيري پرايمر بسيار اختصاصي داخلي براي بروسلا مليتنسيس، واكنشي با حساسيت بسيار بالا بهينهسازي شد. در پايان شرايط به گونهاي طراحي گرديد كه تمام پرايمرها در يك واكنش به تغليظ محصولي با طول تقريباً برابر (به ترتيب 136 و 128 جفت باز) كه در ژل آگارز همپوشاني دارند، كمك كند. در مجموع، در اين بررسي يك روش ساده با حساسيت بالا طراحي شد و به نظر ميرسد اين روش در مقايسه با روشهاي ديگر ابزار مفيدي براي تشخيص بروسلوز انساني و حيواني در سطح آزمايشگاههاي نه چندان مجهز باشد.

Bacteria of the Brucella are responsible for zoonotic infections. Detection of pathogenic species in different country is important. In this research three type sample, pure isolate, Milk and serum were analyzed by molecular approach. We examined peripheral blood from 30 patients affected by brucellosis, and 100 milk random samples collected from ethnic ranches. Two PCR products was sequenced to confirm identity of amplicons. DNA extraction from all of samples was performed by using a SDS/NET/Proteinase-k lyses procedure followed by phenol-chloroform standard purification method. Presence of Brucella melitensis was identified in 22 cases (73.3%) of patients that were confirmed by serological means and in 14 of milk samples(14%). However it must be considered positive results in vaccinated animals. We optimized a very sensitive reaction, by using of specific primers for amplification of a region of omp31 gene in different species of Brucella in the first round of PCR reaction that followed by a second reaction with very specific nested primers for Brucella melitensis omp31 gene. Primers designed as two PCR products in the first and second round of reaction had a near size (136 and 128bp respectively) and enrich one another. As a result, their bounds in Agarose gel electrophoresis were stopped in the nearly same location. we developed a simple method with high sensitivity, and it may therefore be considered a useful tool for diagnosis of human brucellosis.