تعيين پاتوتيپ هاي قارچ Verticillium dahliae عامل بيماري پژمردگي ورتيسليومي در باغات زيتون طارم با استفاده از تكنيك Nested-PCR

Detection of pathotypes of Verticillium dahliae, the causal agent of olive Verticillium wilt in olive orchards of Tarom using Nested-PCR technique

پژمردگي ورتيسيليومي يكي از بيماري هاي مهم زيتون مي باشد كه توسط گونه Verticillium dahliaeايجاد مي شود. عامل بيماري با تخريب آوندها باعث خشكيدگي شاخه ها، كاهش عملكرد و در نهايت مرگ درختان بيمار مي شود. جدايه هاي قارچ عامل بيماري، با وجود تشابه ظاهري، از نظر علايم و شدت بيماري زايي در دو گروه متمايز تحت عنوان پاتوتيپ هاي برگ ريز (Defoliating) و غير برگ ريز (Non-defoliating) دسته بندي مي شوند. شناخت پاتوتيپ هاي قارچ V. dahliae داراي اهميت زيادي در تعيين استراتژي كنترل بيماري با استفاده از ارقام مقاوم مي باشد. براي شناسايي پاتوتيپ هاي اين قارچ، از درختان زيتون مشكوك به پژمردگي ورتيسيليومي در منطقه طارم در استان زنجان نمونه برداري شد. با استفاده از روش هاي معمول كشت و خالص سازي قارچ ها، تعداد 12 جدايه قارچ ورتيسيليوم از ساقه هاي آلوده درختان زيتون جداسازي گرديد. متعاقباً DNA كل از ميسليوم و نيز از نهال هاي مايه زني شده با جدايه قارچي استخراج گرديد و واكنش هاي PCR معمولي و Nested-PCR با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي طراحي شده براي دو نوع پاتوتيپ انجام شد. با توجه به طول قطعات DNA تكثير يافته، از بين 12 جدايه قارچ ورتيسيليوم جداسازي شده بيشتر آنها (تعداد 11 جدايه) از نوع پاتوتيپ غير برگ ريز و تنها يك جدايه از نوع برگ ريز تعيين شد. براين اساس پاتوتيپ غير برگ ريز از بيشترين فراواني و توزيع در مناطق زيتون كاري طارم برخوردار است. نتايج اين تحقيق نشان داد كه به دليل حساسيت بالاي روش Nested-PCRدر فاصله زماني كوتاهي پس از مايه زني مي توان قارچ عامل بيماري را در روي ريشه نهال هاي آلوده زيتون رديابي و پاتوتيپ آن را تعيين نمود.

Verticillim wilt is one of the most important olive vascular diseases caused by Verticillium dahliae Kleb. This fungal pathogen prompts wilting, yield loss and eventually death of the infected trees by devastating of their vascular system. The isolates of V. dahliae are grouped, based on the disease symptoms, in two distinct defoliating and non-defoliating pathotypes, although they are morphologically identical. Detection of the pathotype is an important step forward for selecting proper management strategies, especially for screening of resistant cultivars. In this study we used a PCR-based method to detect the pathotype of different isolates of the fungus, collected from Tarom region in Zanjan province. The wood samples collected from the infected olive trees were cultured and purified on solid medium using conventional methods. Total DNA was extracted both from mycelia and from artificially inoculated olive saplings. A nested-PCR assay was performed using specific primer pairs developed for detection of both pathotypes. Based on the size of the PCR products seperated on the agarose gel, most of the isolates (11 out of 12) belonged to the ND pathotype and only one isolate belonged to D pathotype. The results of this research showed that the ND pathotype is probably the most predominantly distributed pathotype of V. dahliae in Tarom region. Because of the high sensitivity of the nested –PCR, it is possible to survey and to detect the fungus Verticillium on olive, shortly after inoculation of the saplings.